17-β雌二醇對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨化遷移的調(diào)控作用及其機(jī)制.pdf

1、盆底局部肌組織再生能力障礙是女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)發(fā)生的重要原因。除了傳統(tǒng)的手術(shù)和藥物治療以外,干細(xì)胞移植是目前行之有效且具有廣闊前景的一種 SUI治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是組織工程(Tissue Engineering)重要的種子細(xì)胞。BMSCs移植到 SUI患者的尿道周圍組織后,可通過

2、替代、修復(fù)受損的尿道括約肌,增強(qiáng)尿道括約肌張力,改善尿控功能,有望從根本上治療SUI。干細(xì)胞移植入體內(nèi)后向靶組織和器官的募集情況,是整個干細(xì)胞治療成功與否的基礎(chǔ),直接關(guān)系到其治療效果,因而一直是組織工程領(lǐng)域備受關(guān)注的問題。目前干細(xì)胞移植普遍存在著歸巢率低、療效欠佳的現(xiàn)狀,如何人為地有效引導(dǎo)干細(xì)胞向靶組織募集,提高干細(xì)胞的歸巢率,是當(dāng)下急需解決的問題之一。
　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell derived factor

3、-1,SDF-1)及其受體CXCR4所構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在干細(xì)胞歸巢的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。CXCR4廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞,在BMSCs亦有表達(dá)。SDF-1可誘導(dǎo)CXCR4+細(xì)胞從低濃度向高濃度趨化遷移?；诩?xì)胞的這種趨化特性,我們可以通過調(diào)節(jié) SDF-1/CXCR4軸的表達(dá),間接對這種趨化作用的強(qiáng)弱進(jìn)行人為調(diào)控。已有研究證實(shí)雌激素可以上調(diào) SDF-1/CXCR4軸的表達(dá),提示雌激素干預(yù)可作為調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4表達(dá)

4、的手段,進(jìn)而調(diào)控BMSCs的趨化遷移。
　　本研究以3周齡的雌性SD大鼠為材料,全骨髓+貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs,以不同濃度的17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)分別干預(yù) BMSCs,檢測其 CXCR4基因和蛋白的表達(dá)變化,從中選擇可誘導(dǎo)BMSCs獲得最高表達(dá)CXCR4的E2濃度,觀察該濃度E2干預(yù)的BMSCs趨化能力的變化。主要實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果如下:
　　一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、

5、培養(yǎng)與鑒定
　　1. BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　無菌條件下取3周齡雌性SD大鼠雙側(cè)脛骨、腓骨,暴露骨髓腔,含10％FBS的DMEM-F12充分沖洗骨髓腔,收集全部沖洗液,離心后留取沉淀加入10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液,于37℃,含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第三代細(xì)胞經(jīng)抗體孵育后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD44、CD45、CD31、CD29和CD166的表達(dá)情況。結(jié)果:分離出的細(xì)胞傳至第三代時形態(tài)均一,呈長梭

6、形,其細(xì)胞表面CD44、CD29高表達(dá),CD45、CD31和CD166低表達(dá),符合BMSCs的免疫表型特點(diǎn)。
　　二、BMSCs CXCR4表達(dá)的測定
　　1. PCR法檢測BMSCs CXCR4表達(dá)
　　以106/孔的細(xì)胞量將第2代 BMSCs接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿60%~70%時進(jìn)行雌激素干預(yù)實(shí)驗(yàn)。本研究設(shè)置6個17β-E2干預(yù)濃度,即10-10、10-9、10

7、-8、10-7、5×10-7和10-6 mol/L。2個實(shí)驗(yàn)組分別為 E2干預(yù)組和 E2拮抗組。E2拮抗組的細(xì)胞預(yù)先用10-8mol/L雌激素受體拮抗劑ICI182780封閉1h。每組設(shè)置13個孔,分別編號為1-13號,分別以1號孔為對照。E2干預(yù)組2-7號孔和8-13號孔分別依次加入不同濃度(10-10、10-9、10-8、10-7、5×10-7、10-6 mol/L)的17β-E2進(jìn)行干預(yù),E2拮抗組每孔在E2干預(yù)基礎(chǔ)上再向每孔以1

8、0-6mol/L ICI182780拮抗雌激素受體(ER)。干預(yù)組和拮抗組的2-7號和8-13號孔E2干預(yù)時間分別為24h和48h。干預(yù)完成后收集BMSCs,PCR法檢測各孔細(xì)胞CXCR4 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:干預(yù)24h時,CXCR4 mRNA表達(dá)在10-7mol/L17β-E2誘導(dǎo)時表達(dá)最高;干預(yù)48h時,CXCR4 mRNA在5×10-7 mol/L17β-E2誘導(dǎo)時表達(dá)最高.10-8 mol/L的 ICI182780能夠明顯抑

9、制17β-E2對BMSCs CXCR4 mRNA表達(dá)的調(diào)高作用。
　　2. Western blot法檢測BMSCs CXCR4表達(dá)
　　按上述方法用各濃度17β-E2和ICI182780處理干預(yù)組和拮抗組BMSCs,收集細(xì)胞用Western blot法檢測各濃度17β-E2誘導(dǎo)后CXCR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果:干預(yù)24h和48h時,CXCR4蛋白表達(dá)均在5×10-7 mol/L17β-E2誘導(dǎo)時表達(dá)最高。10-8 mol/L的

10、ICI182780能夠明顯抑制17β-E2對BMSCs蛋白表達(dá)的調(diào)高作用。
　　三、17β-E2對BMSCs定向遷移影響的檢測
　　1.17β-E2對BMSCs向SDF-1定向遷移的影響
　　實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行,設(shè)置對照組和E2干預(yù)組。對照組BMSCs未經(jīng)E2干預(yù),E2干預(yù)組BMSCs預(yù)先在含10-7mol/L17-β雌二醇的10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。每組分別設(shè)置4孔,標(biāo)記為1-4號。兩組孔內(nèi)均依次加入

11、含0、100、200、300 ng/mL SDF-1的無血清培養(yǎng)基500μL,利用懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室 transwell(8μm)觀察細(xì)胞的遷移情況。transwell內(nèi)按2×104/孔接種細(xì)胞。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,進(jìn)行洗滌、固定和伊紅染色。顯微鏡下隨機(jī)取5個視野(光鏡×100倍)計(jì)數(shù)染色細(xì)胞,SPSS13.0對遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:對照組和 E2干預(yù)組 BMSCs均在 SDF-1濃度為200ng/ml時細(xì)胞遷移數(shù)達(dá)到最大,且在

12、相同SDF-1濃度下,E2干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)要顯著大于對照組。
　　2. CXCR4阻斷實(shí)驗(yàn)
　　設(shè)置對照組和E2干預(yù)組,標(biāo)記為5號。按上述方法處理2組細(xì)胞,分別取對照組和E2干預(yù)組細(xì)胞各200μl,加入CXCR4受體阻斷劑AMD3100100ng/mL孵育30min,依照上述步驟行微孔隔離穿越實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:在對照組,CXCR4阻斷后的BMSCs細(xì)胞遷移數(shù)與對照組1號孔無明顯差異;在E2干預(yù)組,CXCR4阻斷后細(xì)胞遷移數(shù)與同組1