轉(zhuǎn)化生長因子-β1調(diào)控Snail表達對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移力的作用研究.pdf

1、第一部分、TGF-β1對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移力及Snail表達的影響。 目的：研究轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）遷移力、對Snail及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達的調(diào)節(jié)作用，以探討TGF-β1對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移力的影響及機制。 方法：采用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，用免疫熒光法對培養(yǎng)第3代的細胞進行鑒定。用改良的Transwell小

2、室檢測不同濃度TGF-β1對細胞遷移力的影響；在同一濃度TGF-β1作用下，RT-PCR檢測MSCs細胞Snail及MMP-2 mRNA表達，Western blot及免疫熒光檢測Snail蛋白表達，以及明膠電泳酶譜法分析上清液中MMP-2活力變化。 結(jié)果：密度梯度離心結(jié)合貼壁法能有效分離、純化大鼠MSCs，免疫熒光檢測顯示培養(yǎng)的細胞CD29、CD44表達陽性，而CD34、CD45表達陰性。外源性TGF-β1對MSCs遷移力的促

3、進作用具有劑量依賴性，在2 ng/ml時達到最高。MSCs同時表達Snail及MMP-2。在2 ng/mlTGF-β1刺激下，Snail mRNA及蛋白表達明顯增高，MMP-2 mRNA及活力明顯增高，與對照組相比具有顯著性差異（P<0.01或P<0.05）。 結(jié)論：TGF-β1可上調(diào)Snail及MMP-2表達，顯著提高MSCs的遷移力。 第二部分、TGF-β1促進骨髓間充質(zhì)干細胞Snail表達的信號傳導(dǎo)通路的研究。

4、 目的：研究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和PI-3K/Akt信號通路在TGF-β1引起骨髓間充質(zhì)干細胞Snail表達改變中的調(diào)控作用。 方法：應(yīng)用Western blot檢測TGF-β1對P-ERK及P-Akt表達的影響以及以不同濃度ERK激酶特異性抑制劑（PD98059）或和PI3K通路特異性抑制劑（Wortmannin）干預(yù)后檢測MS

5、Cs細胞ERK、Akt磷酸化水平變化，確定PD98059和Wortmannin分別抑制Snail誘導(dǎo)的MSCs細胞ERK激酶和Akt激酶磷酸化的有效濃度，進而用RT-PCR、Western blot技術(shù)研究其對TGF-β1誘導(dǎo)MSCs細胞Snail mRNA及蛋白水平影響。 結(jié)果：Western blot分析顯示TGF-β1作用6h后MSCs細胞p-Akt和p-ERK水平較對照組明顯增高；Wortmannin和PD98059可分

6、別以劑量依賴性抑制MSCs細胞p-Akt和p-ERK水平；可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MSCs細胞ERK激酶及Akt激酶磷酸化的PD98059和Wortmannin相應(yīng)濃度分別為30 μmol/L和40 nmol/L。PD98059（30 μmol/L）、Wortmannin（40 nmol/L）明顯抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的Snail mRNA及蛋白水平，而兩者聯(lián)合給予對MSCs細胞Snail mRNA及蛋白表達的抑制作用具有協(xié)同作用，

7、與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論：TGF-β1能促進MSCs的Snail的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達，且ERK1/2及PI3K轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在此過程中具有調(diào)控作用。 第三部分、siRNA阻斷骨髓間充質(zhì)干細胞Snail基因表達的實驗研究。 目的：研究體外化學合成siRNA在MSCs細胞中對目的基因Snail的干擾作用，建立利用RNA干擾技術(shù)研究基因功能的平臺。 方法：以陽離子脂質(zhì)體為載體，將化學

8、合成針對Snail基因的siRNA，轉(zhuǎn)染MSCs細胞，在mRNA水平和蛋白水平評價siRNA對Snail基因表達的抑制作用。 結(jié)果：三條siRNA中，Y2鏈具有最佳干擾效果，自轉(zhuǎn)入細胞12小時起，在72小時內(nèi)，可有效抑制MSCs細胞Snail基因的表達，使Snail基因的mRNA和蛋白表達量顯著下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論：siRNA可以在體外培養(yǎng)細胞中有效的沉默Snail基因，為研究基因

9、功能提供了一個快速、有效的系統(tǒng)。 第四部分、siRNA抑制Snail基因表達在TGF-β1調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞生長和遷移中的作用研究。 目的：以RNAi技術(shù)封閉MSCs細胞中Snail的表達，使外源性、一定濃度的TGF-β1刺激MSCs細胞Snail的轉(zhuǎn)錄受阻，檢測轉(zhuǎn)錄因子Snail在TGF-β1調(diào)控MSCs細胞生長和遷移中的作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染針對Snail基因的特異性小分子干擾RNA（siRNA），MT

10、T法及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后TGF-β1作用對細胞活力及細胞周期的影響，用改良的Transwell小室測定細胞遷移力，RT-PCR及明膠酶譜檢測轉(zhuǎn)染前后TGF-β1作用對MMP-2mRNA表達以及MMP-2活力的影響 結(jié)果：RNA干擾前MSCs在TGF-β1作用24h后平均每個200倍視野穿過濾膜的細胞數(shù)顯著增加，差異有顯著性意義。RNAi后MSCs在TGF-β1作用24h后平均每個200倍視野穿過濾膜的細胞數(shù)與正常對照組相比，