表皮生長因子影響人羊膜間充質(zhì)干細胞遷移的機制.pdf

1、背景及目的：
　　 人羊膜組織產(chǎn)后常被丟棄,作為“廢物”利用,是再生醫(yī)學(xué)和干細胞治療的良好資源。與骨髓間充質(zhì)干細胞類似,從羊膜中分離的間充質(zhì)干細胞具有很好的免疫耐受性,適用于異體干細胞移植,也是干細胞研究的良好對象。
　　 細胞遷移在體內(nèi)組織、器官再生和分化過程中非常重要,因此研究人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)如何在適當(dāng)時間遷移到適當(dāng)部位,在

2、再生醫(yī)學(xué)和干細胞治療中非常必要。表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)在多種類型細胞遷移和增殖中發(fā)揮作用,促進上皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和平滑肌細胞遷移;創(chuàng)傷組織產(chǎn)生的EGF能明顯促進創(chuàng)傷愈合。另外,EGF價格低,可以大量生產(chǎn),且在多種情況下都能保持穩(wěn)定,所以我們選擇EGFR信號通路作為研究對象。有報道EGF能促進大鼠和永生化人骨髓間充質(zhì)干細胞遷移,而在hAMSCs增殖和遷移中的作用未見報道。

3、r>　　 細胞應(yīng)答外界信號分子向特定方向遷移是一個復(fù)雜的過程,需要前端和后部在時空方向上獲得不對稱性。盡管調(diào)控MSC遷移的分子研究很多,但對遷移方向的調(diào)控機制認識較少。由于傷口成功修復(fù)需要MSC在確切時間遷移到確切位置,因此研究干細胞定向遷移(directional migration)對于創(chuàng)傷修復(fù)具有重要意義。
　　 小鼠胚胎干細胞中EGFR.激活可引起下游PI3K/AKT活化,ERK信號通路是EGFR調(diào)控的另一條通路,與細

4、胞增殖和遷移有關(guān)。我們將檢測EGF是否能引起體外培養(yǎng)hAMSCs的定向遷移,探索EGF通過EGFR信號通路促進hAMSCs定向遷移的機制。體外擴增并增強hAMSCs遷移能力能增加體內(nèi)治療干細胞數(shù)量及細胞遷移到損傷組織的能力,有助于提高治療效果。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 酶消化法體外分離hAMSCs,制成單細胞懸液后,以一定細胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5、>　　 2、免疫細胞化學(xué)
　　 免疫細胞化學(xué)檢測干細胞表面標(biāo)志,進行波形蛋白、CD44、CD90、PAK1等染色。
　　 3、檢測細胞增殖
　　 MTT法檢測EGF對hAMSCs增殖的作用,及EGFR抑制劑AGl478、P13K抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126對EGF作用的影響。
　　 4、檢測細胞遷移
　　 劃痕實驗觀察不同濃度EGF對hAMSCs遷移的影響;Transwell小

6、室測定EGF對hAMSCs遷移的作用,及EGFR抑制劑AG1478、PI3K抑制劑LY294002、ERK抑制劑U0126對EGF作用的影響;Dunn chamber法觀察EGF濃度梯度對hAMSCs定向遷移的影響。
　　 5、Western-blot
　　 Western-blot檢測EGF處理后EGFR、AKT、ERK的磷酸化水平的變化,分析其與細胞遷移的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、細胞培養(yǎng)

7、>　　 體外分離的hAMSCs生長狀況良好,接種六七天融合度達90%以上,細胞呈放射狀或漩渦狀排列.傳至3代后呈均勻梭形。
　　 2、免疫染色
　　 免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,本實驗分離獲得的目標(biāo)細胞表達間充質(zhì)細胞標(biāo)志波形蛋白、CD90、CD44,不表達CD14、CD45。
　　 3、檢測細胞增殖
　　 MTT結(jié)果顯示,不同濃度EGF對hAMSCs增殖起到不同程度的促進作用。而EGF對細胞增殖的作用被AG1

8、478、LY294002和U0126抑制。
　　 4、檢測細胞遷移
　　 劃痕實驗結(jié)果顯示,EGF濃度為100ng/ml時對細胞遷移的促進作用最明顯。Transwell結(jié)果顯示EGF促進hAMSCs遷移,AG1478、LY294002和U0126作用后,遷移細胞數(shù)與EGF組相比明顯減少。Dunnchamber結(jié)果顯示EGF濃度梯度能引起hAMSCs定向遷移。
　　 5、Western-blot
　　 We

9、stern blot結(jié)果顯示,EGF對hAMSCs作用過程中存在EGFR和P13K/AKT及ERK1/2的短暫激活。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn),EGF通過激活EGFR其下游的PI3K/AKT和ERK1/2信號通路促進hAMSCs的EGF高濃度方向定向遷移,但EGF啟動hAMSCs定向遷移的具體機制還有待進一步研究。EGF可激活PAK1表達,因此PAK1可能參與hAMSCs的定向遷移。表達譜分析發(fā)現(xiàn)的顯著差異表達基因