人羊膜負(fù)載羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)皮膚創(chuàng)作的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 皮膚作為一種特殊的器官，是人類與外界接觸的第一道屏障，它是機(jī)體免于脫水、損傷、感染的第一道防線，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和阻止微生物、化學(xué)物質(zhì)等侵入的屏障[1,2,3]。皮膚創(chuàng)傷愈合較為復(fù)雜，盡早修復(fù)缺損皮膚并最大可能恢復(fù)功能與外觀已成為治療重要目標(biāo)，促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合具有重要的理論和實(shí)際意義[4，5]。傳統(tǒng)修復(fù)方法有：自體植皮、同種異體植皮、異種植皮和人工合成皮膚產(chǎn)品的應(yīng)用[6]。但無論同體或異體皮移植均受到供體來源

2、的限制，異體皮和人工合成皮膚代用品的移植還受到發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的困擾[7，8]，尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上一個(gè)亟待解決的難題。
　　 人羊膜(HAM)是一種天然高分子生物材料，含膠原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板層體等多種成分，它表達(dá)多種生長(zhǎng)因子及其mRNA的相關(guān)蛋白，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，可促進(jìn)上皮形成，抑制炎癥和新生血管形成，還可以抑制纖維化減少瘢痕形成，并可作為細(xì)胞移行生長(zhǎng)的良好支架，有利于組織修復(fù)[9]。人羊膜

3、間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，易在體外培養(yǎng)，并能大量擴(kuò)增，有遺傳性狀穩(wěn)定，增殖能力強(qiáng)，低免疫原性等生物學(xué)特性，并能產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子[10,11]。
　　 本實(shí)驗(yàn)將HAM負(fù)載hAMSCs，覆蓋于SD大鼠皮膚創(chuàng)面，觀察它們對(duì)創(chuàng)面愈合的作用，同時(shí)檢測(cè)各組中皮膚CK19陽性細(xì)胞的分布和血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，判斷表皮干細(xì)胞和血管生成情況。
　　 方法：
　　 1、原代分離培養(yǎng)

4、hAMSCs:將新鮮羊膜用PBS液反復(fù)清洗，采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法分離人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，使用含10％FBS DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、hAMSCs的鑒定：采用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析其表型特征。
　　 3、羊膜負(fù)載hAMSCs:羊膜用胰酶消化去上皮細(xì)胞，細(xì)胞以1.54×105/cm2密度種于羊膜上，加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　 4、建立大鼠全層皮膚創(chuàng)傷模型：

5、在大鼠背部做2cm×2cm創(chuàng)面，形全層皮膚缺損，創(chuàng)面隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、羊膜組、羊膜負(fù)載hAMSCs組。
　　 5、免疫組化染色：用免疫組織化學(xué)染色法觀察各組大鼠皮膚修復(fù)中CK19陽性細(xì)胞的分布和VEGF表達(dá)情況。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以（x±s）表示，用t檢驗(yàn)比較組間差異，用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、從羊膜中成功分離出

6、hAMSCs原代細(xì)胞，經(jīng)過24h體外培養(yǎng)后有少量貼壁細(xì)胞，6d后貼壁細(xì)胞迅速增多，培養(yǎng)至第14d，細(xì)胞融合，形態(tài)比較均一，呈放射狀或漩渦狀分布。傳代后hAMCs增殖迅速，保持良好的增殖能力；傳至8代以后，細(xì)胞增殖減緩。
　　 2、hAMSCs表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白、CD90、CD44，不表達(dá)CD105、CD45。
　　 3、人羊膜負(fù)載hAMSCs組傷口愈合速度明顯快于羊膜組和對(duì)照組(P＜0.05)；皮膚切片HE染色