人胎盤羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及安全性研究.pdf

1、研究背景：干細(xì)胞作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，能進(jìn)一步分化成為多種類型的細(xì)胞，構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織和器官。以干細(xì)胞治療為核心的再生醫(yī)學(xué)，將成為繼藥物治療、手術(shù)治療后的另一種疾病治療途徑，從而成為新醫(yī)學(xué)革命的核心。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是應(yīng)用較多的一類具有多向分化能力的成體干細(xì)胞。利用回收的胎盤羊膜組織分離冷凍保存其富含的間充質(zhì)干細(xì)胞，完善干細(xì)胞庫儲備，對于科學(xué)研究、臨床利

2、用干細(xì)胞資源治療有著重要意義。
　　目的：本研究旨在分離、培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)，并進(jìn)行體外長期傳代培養(yǎng)，通過細(xì)胞形態(tài)、膜表面標(biāo)志以及分化特性進(jìn)行鑒定，同時對遺傳穩(wěn)定性和致瘤性進(jìn)行研究，從而觀察該細(xì)胞是否能長期保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的儲備和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:無菌條件下從新鮮人胎盤組織分離出羊膜，采

3、用組織貼壁法和酶消化法在37℃、5％CO2下進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)，對不同代數(shù)的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測其膜表面標(biāo)志物；并通過將其向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察其分化能力；采用染色體G顯帶法制備和分析傳代細(xì)胞染色體核型；通過裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)觀察hAMSCs的致瘤性。
　　結(jié)果：體外傳代培養(yǎng)的hAMSCs形態(tài)似長梭型，呈流水狀生長，細(xì)胞活性高，凍存復(fù)蘇后仍能保持正常形態(tài)，并可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增，細(xì)胞生長曲線呈“S”型;CD

4、90、CD73、CD44、CD105的表達(dá)量分別是94.6%、92.3%、94.7%和91.2%，而CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)量是0.6%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性;而在分化實(shí)驗(yàn)的過程中，利用β-巰基乙醇、丁羥基茴香醚向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)，細(xì)胞出現(xiàn)多個神經(jīng)軸突，神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測，DAB染色呈黃色；利用β-甘油磷酸鈉、維C和地塞米松向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈紅色；利用肝細(xì)胞生長因子

5、、堿性成纖維細(xì)胞生長因子以及制瘤素等向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo),甲胎蛋白檢測，DAB染色呈黃色；P3-P10代的hAMSCs細(xì)胞染色體核型分析顯示均為正常二倍體核型，未見易位、缺失、重復(fù)等異常改變;裸鼠經(jīng)皮下注射hAMSCs后，一般狀況良好，注射部位皮膚未見腫瘤形成，各器官組織切片結(jié)果與正常對照組無區(qū)別，未見異常改變。
　　結(jié)論：人胎盤羊膜組織中富含間充質(zhì)干細(xì)胞，且該細(xì)胞可在體外穩(wěn)定擴(kuò)增培養(yǎng)，10代以內(nèi)具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性和分化能力，未