人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠創(chuàng)面愈合相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過建立小鼠背部創(chuàng)面模型，在創(chuàng)面模型建立即刻，采用hAMSCs進(jìn)行創(chuàng)面多點注射，探討hAMSCs局部移植調(diào)控細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面再生愈合的研究，為臨床上將hAMSCs用于皮膚損傷，促進(jìn)再生愈合提供重要依據(jù)。
　　方法：采用機(jī)械分離及酶消化法提取hAMSCs，取生長狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FCM）鑒定hAMSCs表型，MTT法繪制生長曲線，并檢測誘導(dǎo)成骨、成脂能力，鑒定hAMSCs。取63只健康雄性C57BL/6野生小鼠

2、，于小鼠背部中線兩側(cè)建立全層皮膚缺損模型，實驗分為正常組（不作任何處理）、對照組（培養(yǎng)基組）及實驗組（hAMSCs組），正常組7只，對照組、實驗組各28只，再分別根據(jù)建模后時間：1d、3d、7d、14d分為各4組，在創(chuàng)面建立即刻，實驗組分別沿創(chuàng)面邊緣多點注射CM-Dil標(biāo)記的hAMSCs細(xì)胞懸液，對照組予建模后分別沿創(chuàng)面邊緣多點注射培養(yǎng)基，正常組為正常小鼠。對照組、實驗組分別于建模后1d、3d、7d、14d取損傷組7只小鼠處死，肉眼觀察

3、皮膚創(chuàng)面的變化，沿創(chuàng)緣切取創(chuàng)面全層組織。正常組于1d、3d、7d、14d中任意一個時間節(jié)點取7只小鼠在相同部位切取1.0cm2的全層正常皮膚組織，均用-80℃冰箱保存，備用。HE染色觀察創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞浸潤及膠原排列情況。免疫組化染色觀察創(chuàng)面組織內(nèi)IL-10、TGF-β1、IL-1α表達(dá)情況。PCR法檢測創(chuàng)面組織炎癥及修復(fù)相關(guān)因子IL-10、TGF-β1、 IL-1α、VEGF mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：hAMSCs在原代接種

4、24h后，可見貼壁生長，生長曲線顯示第3代細(xì)胞生長曲線呈“S”形，細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21d時行油紅O染色，可見脂滴處呈紅色，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d行茜素紅S染色，可見紅色鈣化結(jié)節(jié)。通過CM-Dil示蹤顯示hAMSCs于移植14天后仍然存活。FCM結(jié)果顯示：第3代hAMSCs均高表達(dá)CD90、CD105、CD73，其陽性率分別97.1％、95.1%、97.9%，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR，其陰性率為0.

5、7%。HE結(jié)果顯示：正常組為正常皮膚組織，無炎性細(xì)胞浸潤，膠原排列呈網(wǎng)狀，膠原間間隙較寬；對照組、實驗組小鼠創(chuàng)面組織1d均有大量炎性細(xì)胞浸潤且無明顯差異，實驗組小鼠創(chuàng)面組織3d、7d炎性細(xì)胞浸潤較對照組減少，14d對照組、實驗組炎性細(xì)胞浸潤無明顯差異；1d、3d對照組、實驗組膠原排列致密，無明顯間隙；7d、14d對照組、實驗組膠原排列呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原間間隙增寬。7d、14d對照組、實驗組創(chuàng)面均見新生血管形成，且實驗組新生血管形成數(shù)量均

6、多于對照組。免疫組化結(jié)果顯示：實驗組在建模后1d、3d、7d、14d IL-10的表達(dá)量分別為31.026±1.586、46.485±2.182、40.830±1.002、33.881±1.406；對照組在建模后1d、3d、7d、14d IL-10的表達(dá)量分別為30.079±2.369、37.931±2.421、34.998±1.986、31.794±2.825，其表達(dá)量變化規(guī)律與實驗組相同；正常組IL-10的表達(dá)量為29.417±1.

7、731，在建模后1d、14d，實驗組IL-10的表達(dá)量與對照組及正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3、7d，與對照組級正常組比較，實驗組IL-10的表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.05）。實驗組在建模后1d、3d、7d、14d TGF-β1的表達(dá)量分別為23.945±1.812、28.600±2.444、33.853±2.132、36.536±2.138，其表達(dá)量逐漸增高，14d達(dá)到最高；對照組在建模后1d、3d、7d、14d TGF-β

8、1的表達(dá)量分別為25.053±1.913、39.280±2.279、43.932±1.293、47.821±1.748，其表達(dá)量的變化規(guī)律與實驗組相同；正常組TGF-β1的表達(dá)量為24.703±1.799，建模后1d，實驗組TGF-β1的表達(dá)量與對照組及正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3、7、14d，與對照組比較，實驗組TGF-β1的表達(dá)量明顯下調(diào)（P<0.05）。實驗組在建模后1d、3d、7d、14d IL-1α的表達(dá)量分別為

9、26.005±2.023、31.873±2.211、43.101±3.746、46.216±1.959，其表達(dá)量逐漸增高，14d達(dá)到最高；對照組在建模后1d、3d、7d、14d IL-1α的表達(dá)量分別為28.154±2.744、32.127±1.447、39.122±1.877、40.539±1.497，其表達(dá)量的變化規(guī)律與實驗組相同，在建模后1d、3d，實驗組 IL-1α表達(dá)量與對照組無明顯差異（P>0.05），建模后7d、14d，與

10、對照組比較，實驗組 IL-1α的表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.05），正常組 IL-1α的表達(dá)量為25.566±2.501，明顯低于實驗組（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示：實驗組在建模后1d、3d、7d、14d IL-10 mRNA的表達(dá)量分別為0.0152±0.0026、0.2828±0.0133、0.0535±0.0054、0.0209±0.0054呈逐漸升高趨勢，對照組在建模后1d、3d、7d、14d IL-10 mRNA表達(dá)量分

11、別為0.0128±0.0022、0.1209±0.0043、0.0326±0.0047、0.0148±0.0028,其變化規(guī)律與實驗組相同，正常組IL-10 mRNA的表達(dá)量為0.0119±0.033；建模后1d、14d，實驗組IL-10 mRNA的表達(dá)量與對照組級正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3d、7d，與對照組及正常組比較，實驗組IL-10 mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.05）。實驗組在建模后1d、3d、7d、14d

12、TGF-β1 mRNA表達(dá)量分別為0.0162±0.0035、0.0205±0.0031、0.0286±0.0025、0.0358±0.0019，呈逐漸升高趨勢，對照組在建模后1d、3d、7d、14d TGF-β1 mRNA表達(dá)量分別為0.0142±0.0029、0.0276±0.0032、0.0376±0.0018、0.0467±0.0014，其變化規(guī)律與實驗組相同，正常組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量為0.0137±0.0021；建

13、模后1d，實驗組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量與對照組及正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3d、7d、14d，與對照組及比較，實驗組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)（P<0.05）。實驗組在建模后1、3、7、14d IL-1αmRNA表達(dá)量分別為1.0723±0.0346、1.2908±0.0379、1.3452±0.0293、1.4841±0.0448，呈逐天升高趨勢，對照組在建模后1、3、7、14d IL-1α mRNA

14、表達(dá)量1.0602±0.0354、1.1410±0.0454、1.1834±0.0432、1.3041±0.0538，其變化規(guī)律與實驗組相同，正常組IL-1αmRNA的表達(dá)量為1.0492±0.0288,；建模后1d，實驗組IL-1αmRNA的表達(dá)量與對照組及正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3d、7d、14d，與對照組及正常組比較，實驗組IL-1α mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.05）。以上細(xì)胞因子的表達(dá)規(guī)律及形式均與免疫組

15、化結(jié)果相呼應(yīng)。實驗組在建模后1d、3d、7d、14d VEGF mRNA表達(dá)量分別為1.0804±0.0301、1.3509±0.0206、1.5188±0.0228、1.5959±0.0173，呈逐天升高趨勢，對照組在建模后1d、3d、7d、14d VEGF mRNA表達(dá)量1.0433±0.0275、1.1538±0.0118、1.3179±0.0231、1.4075±0.0189，其變化規(guī)律與實驗組相同，正常組VEGF mRNA的表

16、達(dá)量為1.0218±0.0221；建模后1d，實驗組VEGF mRNA的表達(dá)量與對照組及正常組無明顯差異（P>0.05），建模后3d、7d、14d，與對照組及正常組比較，實驗組VEGF mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：(1) hAMSCs局部移植可以下調(diào)創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)。
　　(2) hAMSCs調(diào)控創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的作用，可能與其能夠上調(diào)創(chuàng)面IL-10、IL-1α、VEGF表達(dá)以及下調(diào)TGF-β1的表達(dá)有關(guān)