受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對肝移植大鼠細(xì)胞因子的影響.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官和重要的代謝器官，具有多種重要而復(fù)雜的生理功能，包括：分泌膽汁、代謝功能、凝血功能、解毒作用、吞噬或免疫作用。正因?yàn)橛兄绱酥匾墓δ埽闻K疾患尤其是終末期肝病也就成為了影響人們生命健康和生活質(zhì)量的重要疾病。自1963年3月1日Starzl等首先在美國科羅拉多大學(xué)為1例3歲先天性膽管閉鎖綜合癥患兒施行原位肝移植以來，肝臟移植逐漸成為了治療終末期肝病的最佳選擇之一，為許多病人帶來了佳音。但術(shù)后排斥反應(yīng)仍是影響患

2、者生存的主要障礙。其中急性排斥反應(yīng)則較為常見，約70％的肝移植患者有不同程度的急性排斥，是肝移植術(shù)后早期肝功能障礙的主要原因。急性排斥反應(yīng)又稱細(xì)胞性排斥，是由受體T淋巴細(xì)胞被供肝樹突狀細(xì)胞的異源性抗原激活后，受體T淋巴細(xì)胞活化聚集于供肝樹突狀細(xì)胞周圍，通過分泌細(xì)胞因子引起的膽管上皮及靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。其免疫學(xué)表現(xiàn)為Th1細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子分泌增加，病理學(xué)表現(xiàn)為匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤，小膽管及靜

3、脈內(nèi)皮壞死、脫落等，以術(shù)后7-14天最為明顯。CD4+Th細(xì)胞可分化為Th1和Th2細(xì)胞亞群，其中Th1細(xì)胞因子通過促進(jìn)同種抗原特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞和遲發(fā)型過敏反應(yīng)啟動(dòng)排斥反應(yīng)，Th2細(xì)胞因子通過刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生特異性抗體在慢性移植物排斥反應(yīng)中發(fā)揮作用。Th1/Th2兩類細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子變化是免疫反應(yīng)的指標(biāo)，Th1細(xì)胞因子高表達(dá)可以誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞則可通過抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)Th1細(xì)胞的效應(yīng)從而有利于免疫耐受

4、的建立。因此Th1/Th2細(xì)胞通過彼此產(chǎn)生的細(xì)胞因子維持體內(nèi)免疫狀態(tài)的平衡，平衡失調(diào)則導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)或免疫耐受的發(fā)生。目前針對肝移植急性免疫排斥反應(yīng)大多采用免疫抑制劑，但均不能完全抑制排斥并有諸多副作用。誘導(dǎo)外周免疫耐受減輕或阻止免疫排斥是一種較為理想的方法。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多向分化潛能性與自我更新的細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫學(xué)與替代學(xué)特性。替代學(xué)方面的研究認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有向肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞分化的能力，而免疫

5、學(xué)方面的研究認(rèn)為MSC表達(dá)低水平的MHCII類分子及Fas配體，不表達(dá)T細(xì)胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L，免疫原性較弱，不激活異基因活化的T淋巴細(xì)胞，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制作用，可能誘導(dǎo)免疫耐受。并且其源于受體自身，容易獲取、培養(yǎng)簡單可反復(fù)采取，因此本課題將Lewis來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注DA→Lewis的原位肝移植急性免疫排斥模型受體內(nèi)，觀測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對血清細(xì)胞因子的影響，以證實(shí)受體骨髓間充質(zhì)

6、干細(xì)胞輸注在肝移植術(shù)后的作用。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容共分二部分： 第一章：受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化的方法，比較紅細(xì)胞裂解法和密度梯度離心法分離的優(yōu)劣，就大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表型、細(xì)胞周期、生長曲線等方面進(jìn)行初步分析。 方法：取健康清潔級(jí)雄性Lewis大鼠18只，體重約100克，四周齡，無菌條件下取得雙側(cè)股骨與脛骨，完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔。分別用紅細(xì)胞裂解

7、法和密度梯度離心法分離細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)法擴(kuò)增和純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。光鏡下觀察MSCs形態(tài)特征、生長變化和細(xì)胞數(shù)量，并繪制生長曲線；臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測MSCs表面標(biāo)記和細(xì)胞周期。 結(jié)果：紅細(xì)胞裂解法分離所得細(xì)胞數(shù)量較多，24小時(shí)開始貼壁，10-14天貼滿瓶底，密度梯度離心法獲得細(xì)胞數(shù)量少于裂紅法，24小時(shí)部分貼壁，但是增殖速度快于裂紅法所獲得MSCs。典型的MSCs貼壁生長，形態(tài)以紡錘形和長梭形為主，旋渦狀

8、盤旋排列。細(xì)胞活力均為98％。第3代(P3)細(xì)胞表型測定CD29陽性率95.3％，CD44陽性率94.7％，CD34陰性率1.8％，CD45陰性率為0.8％，細(xì)胞周期測定G0/G1期細(xì)胞約為82.9％，S+G2+M期的細(xì)胞為17.1％。MSCs的生長曲線呈S形，并且傳代后可見，細(xì)胞潛伏期和指數(shù)生長期均相對縮短，平臺(tái)期提前，細(xì)胞生長逐漸減慢。 結(jié)論：1.紅細(xì)胞裂解法與密度梯度離心法都能夠獲取MSCs，前者更為簡便，獲取的細(xì)胞數(shù)量也

9、更多；2.裂紅法與密度梯度離心法分別與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，都能純化MSCs，在貼壁速度方面，后者優(yōu)于前者。 第二章：受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝移植大鼠細(xì)胞因子的影響 目的：觀測輸注受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝移植術(shù)后大鼠生存期、肝功及細(xì)胞因子的影響。 方法：取DA與Lewis大鼠各39只，建立DA→Lewis原位肝移植模型，隨機(jī)分為3組，每組13對，移植術(shù)后每對組合中供體死亡，剩下受體，即為每組13只。術(shù)后受體每組中10

10、只用于檢測肝功及細(xì)胞因子，另3只用于三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病理學(xué)檢測。 A組：僅行原位肝移植術(shù)共13對；B組：原位肝移植術(shù)+MSCs共13對；C組：原位肝移植術(shù)+CsA共13對。 1.觀測術(shù)后一般情況和生存時(shí)間； 2.術(shù)后7d、14d、1mon分別處死術(shù)后受體大鼠1只，觀測肝組織病理變化。 3.術(shù)后7d、14d、1mon分別采血，測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及血清總膽紅素(TBil)值。 4.術(shù)后1d

11、、7d、14d、1mon分別采血，Luminex液相芯片平臺(tái)檢測細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IL-10，IFNγ的含量。 結(jié)果： 1.一般情況及生存時(shí)間：A組術(shù)后3d進(jìn)行性惡化，術(shù)后10-16d自然死亡。B、C組大鼠在術(shù)后14d后逐漸好轉(zhuǎn)，1mon后活動(dòng)增多體重逐漸增加。生存期比較B組、C組較A組生存時(shí)間明顯延長(P<0.001)，B組較C組生存時(shí)間明顯延長(P<0.001)； 2.病理學(xué)：A組呈重度急性排斥反應(yīng)

12、，B組呈輕度急性排斥反應(yīng)。C組呈中度急性排斥反應(yīng)； 3.肝功：術(shù)后7dA、B、C三組ALT、TBil值均有升高，其中A組最高，B組最低，組間差異有顯著意義(P<0.001)。術(shù)后14dB、C組ALT值均有升高，其中B組ALT、TBil值均低于C組，差異有顯著意義(P<0.001)。術(shù)后1monB、C組ALT值仍未恢復(fù)至正常，其中B組ALT、TBil值均較C組低，差異有顯著意義(P<0.001)； 4.細(xì)胞因子：IL-2、

13、IL-4、IL-10，IFNγ在術(shù)后1d、7d均有升高，但B組、C組低于A組(P<0.001)，術(shù)后14d、1monB組細(xì)胞因子IL-4、IL-10濃度高于C組，B組細(xì)胞因子IL-2、IFNγ濃度低于C組(P<0.001)。 結(jié)論： 1.肝移植術(shù)后輸注受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有助于延長生存期，并可改善肝功能，其效果優(yōu)于CsA； 2.MSCs可以改變T細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌量，在肝移植術(shù)后有利于免疫耐受的形成，其免疫抑