間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注誘導大鼠胰島移植免疫耐受.pdf

1、本文擬應用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）糖尿病大鼠模型進行同種異體胰島移植，以供體來源的間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞共同靜脈預輸注的方法，觀察胰島移植物的存活時間，了解間充質干細胞調節(jié)免疫反應過程，糖尿病大鼠胰島移植物的存活時間及參與的淋巴細胞類型、細胞因子變化，為探索胰島移植后免疫耐受的方法開辟多種途徑。 課題分以下三個部分 一、大鼠間充質干細胞體外培養(yǎng)及免疫學特性的研究 目的：體外分離培養(yǎng)和純

2、化骨髓來源的間充質干細胞，研究其體外的生物學特性和對免疫細胞功能的影響及初步機制。 方法：①改良式單純貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠骨髓來源的間充質干細胞，觀察獲得各代細胞形態(tài)及細胞的生長曲線，流式細胞儀檢測第三代細胞生長周期、細胞表面標記，誘導成骨和成脂肪分化。②間充質干細胞與脾淋巴細胞共同體外培養(yǎng)，檢測共培養(yǎng)體系中淋巴細胞增殖、凋亡和淋巴細胞亞群的變化；檢測共培養(yǎng)體系上清液中細胞因子的變化。 結果：①骨髓來源的間充質干細胞呈

3、長梭形，貼壁生長，細胞周期G0～G1期占（81.8±2.8）%；流式細胞儀鑒定干細胞的標志陽性：CD44（99.83%）、CD90（99.67%）；造血干細胞的標志表達陰性：CD34（0.48%），白細胞共同抗原CD45（0.05%）及CD11b（0.1%）。成骨和成脂肪誘導可以使BM-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨細胞和脂肪細胞。②骨髓間充質干細胞與脾淋巴細胞按不同比例共同培養(yǎng)：MSC：L（M/L）為1：1、1：10和1：50

4、時，可以明顯抑制同種異基因來源的淋巴細胞增殖，明顯抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T淋巴細胞的比例，但并不影響體系中CD4+T淋巴比例和淋巴細胞凋亡率。M/L為1：1時可以增加共培養(yǎng)體系中CD4+CD25/CD4+的比例。③上清液細胞因子檢測顯示INF-γ、IL-10及IL-6高表達，IL-2及TNF-α中度表達，IL-4、IL-1α、IL-1β低度表達。M/L為1：10和1：50組上清液IFN-γ水平下降；M/L1：10組上清液IL-6水平升

5、高，而TNF-α水平下降。 結論：體外培養(yǎng)可以獲得大量生物學特性均一的大鼠骨髓間充質干細胞，在體外具有抑制淋巴細胞增殖，調整T淋巴細胞亞群的作用，機制可能是通過部分細胞因子來實現(xiàn)。 二、骨髓間充質干細胞在異基因正常大鼠體內(nèi)的分布和對活體免疫功能的影響 目的：研究骨髓間充質干細胞輸注后在體內(nèi)的分布情況和對活體正常同種異基因大鼠免疫功能的影響。 方法：①Wistar大鼠來源的骨髓間充質干細胞，CFSE染色后以

6、5×106/只經(jīng)尾靜脈注入SD大鼠體內(nèi)。分別在24小時、48小時、72小時、1周及2周處死受體大鼠，取脾臟、肺、肝臟進行冰凍切片，骨髓細胞涂片后熒光顯微鏡觀察，以及流式細胞術分析骨髓間充質干細胞在體內(nèi)的分布情況。②24只SD大鼠隨機分為2組，實驗組按5×106/只尾靜脈注射骨髓間充質干細胞，對照組注射PBS。在注射后1，2，3，4周分別處死實驗組和對照組大鼠各3只，取脾淋巴細胞行淋巴細胞增殖實驗和單向混合淋巴反應（MLR）。③20只SD

7、大鼠隨機分為4組，每組5只，每只大鼠分別通過尾靜脈注射5×106，5×105，5×104骨髓間充質干細胞及1mlPBS。10天后處死全部大鼠行單向混合淋巴細胞實驗，流式細胞術分析大鼠外周血和脾臟淋巴細胞亞群的變化 結果：①注入細胞24小時、48小時，BM-MSCs細胞聚集以肺為主；72小時后細胞聚集以脾臟和骨髓為主。在1周時脾臟、肝臟及骨髓內(nèi)仍然可以見到較多細胞；超過兩周后逐漸消失。②在ConA刺激下，實驗組大鼠的脾淋巴細胞可以

8、正常增殖。在與SD大鼠來源的脾淋巴細胞進行MLR發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠1周、2周的OD值與正常對照組相比有顯著差異（P=0.000）。③不同濃度組的MLR結果表明，注射5×106細胞組脾淋巴細胞MLR受到抑制（P=0.000），外周血、脾臟CD4+T較對照組降低（P=0.014，P=0.009），外周血CD8+T較對照組降低（P=0.020），外周血和脾臟CD4+CD25+/CD4+均升高（P=0.009，P=0.006）。 結論：骨

9、髓間充質干細胞在注射后短時間內(nèi)滯留以肺為主，在1周～2周后在脾臟和骨髓。骨髓間充質干細胞的免疫抑制作用受時間限制，超過2周后作用消失；且在體內(nèi)發(fā)揮作用要達到5×106以上，可以降低體內(nèi)CD4+T細胞亞群水平，部分降低CD8+，升高CD4+CD25/CD4+百分率。 三、骨髓間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞（BMC）輸注誘導胰島移植免疫耐受及其機制的研究 目的：骨髓間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞共同靜脈輸注誘導胰島移植免疫耐受的方法及作

10、用機制，為尋找誘導胰島移植免疫耐受的方法開辟新的途徑，提供新的依據(jù)。 方法：①建立糖尿病動物模型：注射劑量按照35mg/kg·體重，連續(xù)5天。每周監(jiān)測隨機血糖3次，連續(xù)2周血糖超過16.7mmol/L以上者認為造模成功。②大鼠胰島細胞的分離純化：采用膠原酶P胰管灌注消化，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化Wistar大鼠胰島；⑨嵌合體模型的建立：采用60Coγ射線全身照射，劑量為7Gy。全身照射（TBI）后4小時內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入B

11、M-MSCs/和BMC。移植術后14天定量PCR檢測嵌合率。④間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注對糖尿病胰島移植物的影響：以雄性Wistar大鼠為骨髓間充質干細胞供體，雌性Wistar大鼠為骨髓細胞供體，雌性SD大鼠為胰島移植受體。將糖尿病SD大鼠隨機分為單純胰島移植（A組）、單純骨髓間充質干細胞5×106預輸注后胰島移植組（B組）、骨髓間充質干細胞5×105+骨髓細胞1×107預輸注后胰島移植組（C組）及骨髓間充質干細胞5×106+骨髓細胞

12、1×107預輸注后胰島移植組（D組）四組。各組在預處理7天后行胰島移植，將1000IEQ的胰島細胞移植入各組糖尿病大鼠的左腎包囊內(nèi)，比較各組移植物生存時間上的差異。同時各實驗組分別在預處理后第7天（即胰島移植術前）、胰島移植術后7天、14天、21天、排斥后應用放射免疫法測定大鼠血清胰島素水平。D組大鼠在不同的移植時期（包含血糖正常期、排斥期兩個時期）手術將移植物載體腎取出；其余各實驗組在糖尿病SD大鼠移植物排斥后2天，取出其移植物載體腎

13、，做病理切片觀察。⑤對胰島移植糖尿病大鼠混合淋巴細胞反應的影響：D組分別于移植耐受期和排斥后取大鼠脾臟，分離淋巴細胞，與絲裂霉素C處理的供體Wistar大鼠和無關第三品系F344/N大鼠脾淋巴細胞進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，MTT法觀察受體淋巴細胞增殖反應。⑥供體間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注對胰島移植糖尿病大鼠T淋巴細胞亞群及CD4+CD25+T細胞的影響：將糖尿病SD大鼠按上述方法分組，各組分別于預處理后第7天（即胰島移植術前）、胰島移

14、植術后7天、14天、排斥后取外周血及大鼠脾臟制備的淋巴細胞懸液，應用流式細胞儀檢測CD8+、CD4+、CD4+CD25+/CD4+T淋巴細胞比率。⑦骨髓間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注對胰島移植糖尿病大鼠細胞因子微環(huán)境的影響：各組分別于預處理后第7天（即胰島移植術前）、14天、排斥后取外周血清，應用Luminex多功能流式點陣儀液相芯片法檢測白介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）

15、含量；同時應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血清轉移生長因子-β1（TGF-β1）含量。 結果：①以STZ（35mg/kg·體重）多次小劑量經(jīng)腹腔注射的方法，可成功誘發(fā)SD大鼠糖尿病，糖尿病模型建模成功率為98%；②胰島細胞獲取量及細胞活率：每條大鼠胰腺分離、純化后平均可獲取的胰島細胞團數(shù)量為（1063.49±84.74）IEQ，純度>90%。胰島素釋放試驗：低糖組的胰島素釋放量為（2.08±0.56）μIU/Islet，高糖組的釋放量

16、為（7.18±1.32）μIU/Islet。③14天時檢測外周血Y染色體含量檢測，提示只有D組外周血中含有少量的Y染色體，其余兩組均未檢測到。在骨髓、脾臟組織中，三組之間Y染色體含量有差異（P=0.027，P=0.039）D組的含量最高。④D組大鼠胰島移植物生存時間與其它三組比較具有顯著性差異（P=0.000），中位生存時間為30天，最長達32天。C組移植物生存時間也有所延長，中位生存時間為14天。 結論：①采用膠原酶P胰管灌注

17、消化，F(xiàn)icoll-400不連續(xù)梯度純化能分離、純化出較大數(shù)量且功能良好的大鼠胰島細胞。②骨髓間充質干細胞5×106+骨髓細胞1×107能顯著延長同種異體大鼠胰島移植物的存活時間。③以單向混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗證實，預輸注供體骨髓間充質干細胞5×106+骨髓細胞1×107的受體鼠淋巴細胞對供體淋巴細胞刺激的增殖反應具有明顯抑制作用。④嵌合體檢測表明預輸注供體骨髓間充質干細胞5×106+骨髓細胞1×107的受體鼠在血液、脾臟和骨髓形成嵌合體