大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)同種異體心臟移植免疫耐受.pdf

1、器官移植的治療目的是向人體引入異體的細(xì)胞、組織或器官，從而代替喪失相應(yīng)功能的細(xì)胞、組織或器官，并使受體接受，不被機體免疫系統(tǒng)排斥，而且移植物也不排斥宿主。目前器官移植術(shù)后，受體多須終身使用免疫抑制劑，降低受體的全身免疫功能，減少或抑制受體對移植物的免疫排斥反應(yīng)以達(dá)到維持移植物長期存活的目的。但是長期使用用免疫抑制劑導(dǎo)致感染和腫瘤高發(fā)，而且各種免疫抑制劑藥物的毒副作用影響受體的生存質(zhì)量，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致慢性移植物功能衰竭的發(fā)生。此外，即使受

2、體長期服用并能耐受免疫抑制劑，移植物長期存活率也并不理想。誘導(dǎo)受體對供者器官特異性免疫耐受是解決排斥反應(yīng)最理想的措施。也就是說在長期不使用免疫抑制劑的情況下，移植物既不被受體排斥，發(fā)生宿主抗移植物反應(yīng)；同時也不致發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)，但是仍保留對除移植物以外的正常免疫應(yīng)答。 間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的具有多向分化能力的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最豐富。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，可以分化為骨、

3、軟骨、脂肪等；具有較低的免疫原性，在體內(nèi)可以逃避免疫系統(tǒng)的攻擊；同時發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以抑制同種異體 T 細(xì)胞增殖，研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以延長皮膚移植物的存活時間，減少移植物抗宿主病的發(fā)生。近來對間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控功能的研究，提示其在誘導(dǎo)器官移植免疫耐受中的應(yīng)用前景。本研究從大鼠骨髓中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，建立大鼠同種異位心臟移植模型，旨在研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心臟移植中誘導(dǎo)免疫耐受，減少免疫排斥的作用，并探討其可能機制。本研究

4、分為四部分。 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)鑒定，第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種T細(xì)胞的作用及其機制，第三部分大鼠同種異體心臟移植模型的建立，第四部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種異體心臟移植的作用及其機制。 第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)鑒定 [目的] 探討體外分離、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并分析其表型特點；評價大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植的安全性。 [

5、方法] 用密度梯度離心法分離純化大鼠骨髓MSCs，傳代擴(kuò)增，形態(tài)學(xué)觀察，流式細(xì)胞儀分析測定細(xì)胞表面抗原，DAPI標(biāo)記。20只Wistar大鼠，體重200-250g。隨機分為2組：A空白對照組，B MSCs移植組。觀察移植術(shù)后大鼠一般情況，術(shù)后7天處死取骨髓涂片，免疫熒光鏡下觀察。 [結(jié)果] MSCs 是骨髓細(xì)胞中的單個核細(xì)胞，密度梯度離心法能有效分離純化大鼠骨髓MSCs，MSCs 在含 10％胎牛血清的L-DMEM 中生長性狀相

6、對穩(wěn)定，細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，均一表達(dá)CD90，不表達(dá)CD34、CD45。MSCs 移植組可以長期存活，術(shù)后7天骨髓涂片可見存活的MSCs。 [結(jié)論] 本實驗建立了一種體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠骨髓MSCs的方法，MSCs穩(wěn)定表達(dá)CD90，不表達(dá)CD45、CD34；同種異體來源的MSCs可在宿主體內(nèi)存活、定居，并未發(fā)生免疫排斥。 第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種T細(xì)胞的作用及其機制 [目的] 探討骨髓間充質(zhì)

7、干細(xì)胞(MSCs)在混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對同種異體T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的影響，并初步探討其作用機制。 [方法] 建立MSCs和同種異體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，反應(yīng)體系總量2501μl。以SD大鼠的脾T淋巴細(xì)胞為刺激細(xì)胞，以Wistar大鼠的脾T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，分為 6 組。組Ⅰ：對照組，1×10<'5>/50μl 刺激細(xì)胞和 1×10<'5>/50μl反應(yīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)；組Ⅱ：1×10<'5>/50μl反應(yīng)細(xì)胞與1×10<'4>/

8、50μl SD大鼠的MSCs共同培養(yǎng)；組Ⅲ：1×10<'5>/50μl刺激細(xì)胞和1×10<'5>/50μl反應(yīng)細(xì)胞并加入1×10<'4>/100μl SD大鼠的MSCs共同培養(yǎng)；組Ⅳ：細(xì)胞種類及數(shù)量同第三組，另加1-甲基色氨酸(1-MT)(終濃度1mmol/ml)；組Ⅴ：細(xì)胞種類及數(shù)量同第三組，另加植物刺激素(終濃度2μg/ml)；組Ⅵ：每孔加入反應(yīng)細(xì)胞和剌激細(xì)胞各50μl(各含細(xì)胞數(shù)1×10<'5>個)及MSC0.01ml(含細(xì)胞數(shù)1

9、×10<'3>個)?；旌吓囵B(yǎng)120小時，結(jié)束培養(yǎng)前13小時，每孔加入<'3>H-FdR 20ul，以液閃測定儀測定各組的CPM值。反相高效液相色譜法檢測MSC和MLR共培養(yǎng)體系中色氨酸含量。 [結(jié)果] MSCs可以抑制MLC體系中T淋巴細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系；同時MSCs和MLR共培養(yǎng)體系中色氨酸含量明顯降低。1-MT可以阻斷這一作用。 [結(jié)論] MSCs 在體外可抑制同種異體 T 淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，IDO 參

10、與了這種免疫抑制作用。 第三部分同種異體大鼠異位心臟移植模型的建立 [目的]以改良Ono法進(jìn)行大鼠腹部心臟移植，建立動物模型。 [方法]以體重200～250gSD大鼠為供體，體重200～250g的Wistar大鼠為受體，進(jìn)行大鼠腹部異位心臟移植手術(shù)。SD大鼠經(jīng)麻醉、肝素化后，打開胸腔，阻斷主動脈，經(jīng)主動脈根部灌注心肌保護(hù)液，將供體的心臟取下。Wistar大鼠麻醉后，打開腹腔，將供體的主動脈與受體的腹主動脈行端側(cè)吻

11、合，將供體的肺動脈和受體的下腔靜脈行端側(cè)吻合。 [結(jié)果]大鼠異位心臟移植模型成功率達(dá)100％?？偸中g(shù)時間約60～75min，平均(70.1±4.9min)；供心摘取時間約8～12min，平均(10.5±2.3min)；受體準(zhǔn)備時間約11～15min，平均(13.7±2.0min)[結(jié)論]改良Ono法進(jìn)行大鼠腹部心臟移植模型可靠易行，可重復(fù)率高 第四部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種異體心臟移植的作用及其機制 [目的]

12、研究靜脈輸注骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的影響及其機制。 [方法] 64只Wistar大鼠隨機分成4組，每組16只，作為受體。組Ⅰ：空白對照組經(jīng)腰靜脈注射PBS；組Ⅱ術(shù)中經(jīng)腰靜脈注射供體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1×10<'6>/ml；組Ⅲ術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/Kg；組Ⅳ術(shù)中供心經(jīng)腰靜脈注射供體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1×10<'6>/ml，術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/Kg。觀察各組供心存活時間；術(shù)

13、后七天取供心，觀察病理改變，并取脾臟細(xì)胞懸液流式細(xì)胞儀檢測CD4<'+>、CD8<'+>的百分比，計算并比較各組CD4<'+>/CD8<'+>的比值，ELISA法檢測外周血細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平。 [結(jié)果] 移植心臟的存活時間為組Ⅰ：7.5±0.9天；組Ⅱ：15.5±1.6天；組Ⅲ：17.3±1.3天；組Ⅳ：33.4±3.2天。

14、統(tǒng)計學(xué)分析顯示，移植心臟存活時間組Ⅱ比組Ⅰ明顯延長(19<0.05)，組Ⅳ比其它三組明顯延長(P<0.01)。組Ⅳ移植心臟病理改變較其它三組為輕。受體外周血CD4／CD8比例，組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均高于組Ⅰ(P<0.05)；組Ⅳ與其它三組相比亦明顯增高(P<0.05)。受體血清IFN-γ水平，組Ⅱ、Ⅲ明顯低于組Ⅰ，組Ⅳ低于其他三組(P<0.05)。血清IL-10水平，組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均高于組Ⅰ(p<0.05)，組Ⅳ高于組Ⅰ和組Ⅱ(P<0.05)