間充質干細胞輸注誘導小型豬胰島移植免疫耐受的研究.pdf

1、胰島移植重建胰島素分泌系統(tǒng)，是一種有望徹底根治糖尿病的治療方法。2000年，Edmonton方案的成功，標志著胰島移植取得了突破性的進展，從而帶動了胰島移植臨床試驗性治療在世界范圍內(nèi)廣泛展開。然而移植排斥反應和免疫抑制劑長期乃至終身應用所帶來的副作用和潛在危險性如增加感染、腫瘤的發(fā)生等仍難以克服。目前普遍認為，解決異體移植排斥反應的關鍵在于誘導受體對供體的細胞、組織或器官產(chǎn)生免疫耐受。由于移植免疫耐受的機制十分復雜，盡管誘導免疫耐受的方

2、法眾多，但均未能達到完全可靠持久的特異性耐受。骨髓細胞輸注誘導穩(wěn)定的混合嵌合狀態(tài)能夠維持長期的器官移植免疫耐受，在嚙齒類動物主要通過中樞刪除機制來實現(xiàn)。然而，傳統(tǒng)的骨髓細胞輸注雖能在短期內(nèi)達到混合嵌合狀態(tài)，但很快由于嵌合率的急劇下降而使免疫耐受狀態(tài)難以維持。近年來許多研究在骨髓細胞輸注的基礎上，對受體進行多次特異性輸血或供體淋巴細胞輸注，以達到穩(wěn)定的混合嵌合狀態(tài)，然而這樣會增加移植物抗宿主?。╣raft versus host dise

3、ase GVHD）的風險，同時對受體進行的非特異性預處理也會帶來許多的臨床風險，限制了通過骨髓細胞嵌合體來達到器官移植耐受的臨床應用。 間充質干細胞（mesenchymal stem cells MSCs）是存在于成人組織的多能干細胞，可以從成熟的骨髓、脂肪組織、胎盤、頭皮和多種胎兒組織中獲得，具有向骨組織、軟骨和脂肪等的多能分化的潛能。體外實驗還發(fā)現(xiàn)MSCs在特定的條件下可以向肝細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)組織和胰島素陽性細胞等分化。

4、MSCs在心肌損傷的修復，骨代謝紊亂和多種代謝性疾病中顯示出很好的療效。除了以上的組織修復和再生功能外，最近還發(fā)現(xiàn)MSCs還具有逃脫免疫識別和抑制免疫反應的特性。Itakura等同時把供體胰島細胞和MSCs植入大鼠的門靜脈，可以觀察到胰島移植物存活期延長的同時GVHD的發(fā)生率也降低。本實驗室的研究也發(fā)現(xiàn)，對小鼠進行抗CD154預處理后，聯(lián)合輸注MSCs和骨髓細胞比單純骨髓細胞輸注能維持更長時間的混合嵌合狀態(tài)，使胰島移植物存活時間延長。雖

5、然MSCs已成功的應用于骨髓移植過程中發(fā)生GVHD的治療，但其在同種實體器官移植方面的研究還鮮見報道。 因此，本研究在傳統(tǒng)的骨髓細胞輸注誘導胰島移植免疫耐受的同時，對受體進行MSCs輸注，以期找到一種更有效、更安全的誘導胰島移植免疫耐受的方法。由于MSCs容易從骨髓分離和擴增，同時具有逃脫免疫識別和抑制免疫反應的特性，所以在前期小動物實驗的基礎上，進一步探討其在誘導大動物（小型豬）胰島移植免疫耐受中的作用。 目的：

6、 建立小型豬MSCs培養(yǎng)、擴增及胰島分離純化的方法，初步探討MSCs聯(lián)合骨髓細胞輸注誘導同種異體小型豬胰島移植免疫耐受，觀察胰島移植物存活時間及血清胰島素的變化，為尋找誘導胰島移植免疫耐受的新方法提供實驗依據(jù)。 方法： 1、MSCs分離培養(yǎng)、擴增無菌條件下用含肝素注射器抽取動物骨髓20mL，離心棄上清，將細胞輕緩加入預先配好ficoll-paque分離液的離心管中，1500r/min，離心30min，小心吸取中間交界面

7、的單核細胞層，PBS液洗滌兩次，加入L-DMEM培養(yǎng)基，調整細胞數(shù)為1×106/mL，置于37℃，5％CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，48h后換液去除未貼壁的細胞，此后每3～4天換液一次，依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和擴增MSCs，取第五代細胞作為移植供源，調整細胞數(shù)1×10/mL。 2、供體骨髓細胞制備無菌條件下抽取動物骨髓約40mL1000r/min，離心10min，棄上清，收集細胞加入紅細胞裂解液去除紅細胞，1000r/min，離心1

8、0min，用Hank's液洗滌兩次，加入RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調整細胞為1×106/mL，臺盼藍染色記數(shù)檢測活細胞率。 3.糖尿病小型豬模型的建立和胰島移植動物空腹12h，麻醉后將生理鹽水新鮮配制的5％四氧嘧啶（200mg/kg）耳緣靜脈注射，將連續(xù)兩次以上空腹血糖≥7.0mmol/L的動物判定患了糖尿病。無菌條件下將胰島細胞1×105IEQ、骨髓細胞1×1010和/或MSCs1×108混勻，經(jīng)肝門靜脈輸入糖尿病小型豬體內(nèi)

9、，移植后監(jiān)測血糖、胰島素等的變化，連續(xù)兩次血糖大于11.1mmol/L，以第一次時間為排斥反應的時間。 4.小型豬胰島細胞的分離純化放血處死動物后摘取胰腺，胰管灌注膠原酶V，經(jīng)自制的半自動胰腺消化裝置消化分離小型豬胰腺，胰腺消化物用自制的推進式離心管結合HCA-Ficoll單一密度梯度液（1.096/mL）純化，雙硫腙（DTZ）對胰島進行特異性染色，計數(shù)胰島細胞量和純度，并利用胰島素釋放試驗檢測胰島細胞的功能。 5、實驗

10、分組和處理同種異體西藏小型豬分別作供體和受體，A組：單純骨髓細胞輸注組；B組：間充質干細胞聯(lián)合骨髓細胞輸注組。均在胰島移植時經(jīng)肝門靜脈輸注上述細胞。受體小型豬在胰島移植后第二及第五天肌肉注射環(huán)孢素A（CsA）做預處理，劑量為10mg/kg。 結果： 1、MSCs生長情況經(jīng)ficoll分離的原代骨髓單個核細胞鏡下呈圓形，24h后可見少量的貼壁細胞，大而扁平，極少呈梭形，48h后首次換液，貼壁細胞增多，細胞呈梭型，放射形，三

11、角形和不規(guī)則形，原代培養(yǎng)10天，貼壁細胞明顯增多且呈漩渦狀，懸浮細胞基本清除，80％融合時首次傳代。傳代后的細胞生長迅速，分布均勻，細胞呈現(xiàn)紡錘形、星形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，細胞質豐富，核仁明顯，細胞平行排列或漩渦狀生長。 2、純化后，平均每頭小型豬消化胰腺（15.62±1.09）g組織，平均每克小型豬胰腺組織可獲得胰島細胞團（3025.83±350.28）IEQ，胰島純度為（75.97±3.15）％。純化后的胰島細胞高糖時胰島

12、素的釋放量為（35.31±2.09）mIU/L，為低糖時（12.87±0.94）mIU/L的2.74倍（P=0.000），提示純化后胰島細胞功能良好。 3、胰島移植物存活時間B組（17.33±4.16）天與A組（8.33±1.53）天相比顯著延長（P=0.025），說明MSC輸注能顯著的減少移植排斥反應和有效的延長骨髓細胞誘導的胰島移植免疫耐受。 4、MSCs聯(lián)合骨髓細胞輸注組各時間點糖尿病小型豬血清胰島素水平有差異（P

13、=0.000），移植前胰島素水平與移植后7天、移植后14天有顯著性差異（P值均為0.000），以移植后7天、14天較高。排斥后胰島素水平顯著下降；各處理組移植前胰島素水平無差異（P=0.700），MSCs聯(lián)合骨髓細胞輸注組在移植后14天的胰島素水平與單純骨髓細胞移植組有顯著性差異（P=0.000）。 結論： 1、密度梯度分離法和貼壁培養(yǎng)法相結合是一種簡單、有效和經(jīng)濟的分離培養(yǎng)小型豬間充質干細胞的方法。 2.采用膠