臍帶間充質(zhì)干細胞輸注食蟹猴的毒性及免疫學研究.pdf

1、研究目的：
　　間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有再生修復(fù)、免疫調(diào)控、支持造血等重要功能,近年來已成為干細胞研究及應(yīng)用領(lǐng)域的熱點,主要用于治療免疫性、退行性及損傷性等多種難治性疾病。而臍帶(umbilical cord,UC)中MSCs含量豐富,細胞增殖能力強,受病毒等病原微生物污染的風險低,非常適宜體外規(guī)模化擴增、凍存及臨床應(yīng)用,而且臍帶作為胎兒娩出后的“廢棄物”,取材方便,對產(chǎn)婦及新生兒

2、沒有任何風險,不存在倫理學問題。因此,人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)有望成為可以規(guī)?；a(chǎn)的“干細胞治療藥物”。
　　當然,對于細胞治療來說,安全性是首要關(guān)注和亟需研究的問題,特別是非人靈長類動物(non-human primates,NHPs)在親緣關(guān)系上和人類最為接近,在組織結(jié)構(gòu)、病理生理、免疫調(diào)節(jié)和能量代謝等方面與

3、人類高度近似,其研究價值明顯優(yōu)于其他種屬的實驗動物。本課題旨在研究UC-MSCs輸注食蟹猴(Macaca fascicularis)的毒性及主要免疫學指標的影響,并建立食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細胞(Macaca fascicularis umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,mUC-MSCs)的培養(yǎng)及鑒定方法,為UC-MSCs的同種異體臨床應(yīng)用提供非人靈長類動物的試驗支持。
　　研究

4、內(nèi)容與方法：
　　1.人臍帶間充質(zhì)干細胞重復(fù)靜脈輸注食蟹猴4周的毒性試驗及主要免疫學指標的影響。試驗選用食蟹猴24只,隨機分為4組,分別為陰性對照組、溶劑對照組、低劑量組(2×106個/kg)、高劑量組(2×107個/kg)。每周靜脈輸注1次,連續(xù)5次,試驗期間進行臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細胞計數(shù)、凝血功能、血液生化、T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8及CD4/CD8)、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th1/Th2細

5、胞因子(IFN-γ、IL2、IL-4、IL-6、IL-5、TNF)、T淋巴細胞增殖試驗、免疫球蛋白G及hUC-MSCs抗體等指標的監(jiān)測。
　　2.食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及生物學特性。通過剖宮產(chǎn)獲取食蟹猴臍帶,經(jīng)過機械粉碎、酶學消化、貼壁培養(yǎng)傳代,獲得食蟹猴臍帶MSCs,觀察細胞形態(tài)、繪制生長曲線、流式細胞術(shù)測定細胞周期及免疫表型、并鑒定其多向分化潛能。
　　3.食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細胞單次靜脈輸注食蟹猴的毒性試驗及主要免

6、疫學指標的影響。試驗選用食蟹猴3只,單次靜脈輸注mUC-MSCs(2×106個/kg)后,進行臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細胞計數(shù)、凝血功能、血液生化、T淋巴細胞亞群、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th1/Th2細胞因子、免疫球蛋白G等指標的動態(tài)監(jiān)測。
　　研究結(jié)果：
　　1.hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注對食蟹猴的一般生理活動、體重、體溫、心電圖、血常規(guī)、凝血功能、生化等指標均未見有毒理學意義的不可逆的異常改變,注射局

7、部也無明顯刺激性?？赡艿亩拘苑磻?yīng)為PLT、血清TP、無機P的降低(P≤0.05)。hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注對食蟹猴的T淋巴細胞亞群、T淋巴細胞增殖能力、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、血清IgG等指標均未發(fā)生有統(tǒng)計學意義的影響,僅在個別時間點觀察到IFN-γ、IL-4、IL-6與陰性對照組有統(tǒng)計學差異,在3只動物體內(nèi)檢測到hUC-MSCs抗體。
　　2.mUC-MSCs形態(tài)呈梭形,第3代以后細胞的免疫表型顯示高表達CD29、C

8、D73、CD90、CD105、CD166,不表達或低表達CD14、CD31、CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、HLA-DR;在特定的體外誘導(dǎo)條件下,mUC-MSCs可以向骨、脂肪、軟骨分化,細胞周期檢測顯示G0/G1期細胞>90％。
　　3.mUC-MSCs單次靜脈輸注對食蟹猴的一般生理活動、體重、體溫、心電圖、凝血功能均未見有毒理學意義的異常改變。給藥后RBC、HGB、HCT有所下降,而Retic有所升高(P≤0

9、.05);藥后Glb有所下降,A/G有所升高(P≤0.05);輸注mUC-MSCs后D3、D5、D7、D8的CD4+細胞與藥前比較顯著升高,藥后D7的CD8+細胞與藥前比較有所下降,而藥后D3、D5、D7、D8的CD4+/CD8+比例與藥前比較亦顯著升高(P≤0.05);藥后D4的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞較藥前有所升高(P≤0.05);僅在個別時間點觀察到IL-4、IL-6、TNF的改變有統(tǒng)計學差異。給藥前后T淋巴細胞增殖能力及I

10、gG均未見有統(tǒng)計學差異的改變。
　　結(jié)論：
　　1.本試驗成功建立了食蟹猴臍帶MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定方法,發(fā)現(xiàn)mUC-MSCs在細胞形態(tài)、免疫表型、多向分化潛能等方面與目前報道的人臍帶MSCs相似,為同種異體臍帶MSCs的臨床前研究及應(yīng)用提供了非人靈長類動物的研究基礎(chǔ)。
　　2.本試驗從異種及同種異體兩種模式證明了臍帶MSCs靜脈輸注的安全性,在本試驗條件下,hUC-MSCs重復(fù)靜脈輸注食蟹猴的安全劑量為2.0×10