人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法的優(yōu)化及其免疫學(xué)特性.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是來(lái)源于中胚層的一類(lèi)非造血干細(xì)胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，在適宜條件下可分化為多種組織細(xì)胞。MSCs來(lái)源廣泛，除骨髓外還可從脂肪、臍帶血、胎盤(pán)與臍帶等組織中分離獲取。MSCs具有低免疫原性、調(diào)節(jié)免疫、易于轉(zhuǎn)染外源基因、炎癥趨化等特性，使其成為細(xì)胞靶向治療，誘導(dǎo)移植免疫耐受的理想材料。MSCs不受MHC配型的限制，生物安全性較高，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，已成為組

2、織再生工程學(xué)及細(xì)胞免疫抑制劑領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 不斷探尋和改進(jìn)MSCs獲取的來(lái)源和方法，是深入研究和利用MSCs的必要前提。臍帶為分娩廢棄物，來(lái)源豐富，取材簡(jiǎn)單無(wú)痛苦，不受倫理道德限制；且MSCs含量豐富，擴(kuò)增能力較骨髓更強(qiáng)，病毒感染率低。這些優(yōu)點(diǎn)使臍帶源MSCs日益成為研究的熱點(diǎn)。
　　 第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法的優(yōu)化及其特性鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)是一種新型MSCs來(lái)源，目前分離提

3、取的方法主要有：植塊法、臍靜脈內(nèi)膜消化法、聯(lián)合酶序貫消化Wharton'sJelly組織法等方法。我們總結(jié)以上方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并加以嘗試，最終建立了Ⅰ型膠原酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶消化Wharton'sJelly組織的方法，并摒棄了胰蛋白酶序貫消化的方法。分離提取6跟臍帶，成功率100％。
　　 對(duì)于hUC-MSCs的擴(kuò)增，我們采用了LG-DMEM與MesenPro等比例混合培養(yǎng)基的體系，即保證了hUC-MSCs高效穩(wěn)定的擴(kuò)增，又相對(duì)節(jié)約

4、了成本。該體系較一般的LG-DMEM完全培養(yǎng)基體系，能很好的保持細(xì)胞形態(tài)和更為高效的擴(kuò)增速率。原代培養(yǎng)平均時(shí)間為13.83±1.21天，再經(jīng)12天連續(xù)擴(kuò)增可獲得108數(shù)量級(jí)細(xì)胞，為MSCs的研究和應(yīng)用提供有力保證。
　　 采用該分離擴(kuò)增方法可獲取高純度的hUC-MSCs，經(jīng)鑒定，其免疫表型與BM-MSCs基本相同，且可成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。
　　 第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞體外活化增殖和細(xì)胞因子分泌的

5、影響
　　 MSCs具有免疫抑制作用，在動(dòng)物移植模型的抗排斥和治療造血干細(xì)胞移植所致的GVHD中已初見(jiàn)成效。體外實(shí)驗(yàn)中MSCs可抑制多種免疫細(xì)胞，可抑制多種刺激誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖，但其機(jī)制尚不完全清楚，許多研究結(jié)果間還存在沖突。hUC-MSCs在此方面的研究較少，而與經(jīng)典BM-MSCs的比較則更少。
　　 在該部分，我們觀察了hUC-MSCs對(duì)PHA刺激的PBLs增殖的影響，用BrdU摻入的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行抑制率定量測(cè)定

6、并與hBM-MSCs比較。發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源的MSCs均可顯著抑制T細(xì)胞增殖，抑制效果與MSCs數(shù)量呈正相關(guān)，但hUC-MSCs的抑制作用略弱于BM-MSCs[1∶5(MSCs：PBLs)組，抑制率55.11％VS.70.96％，P＜0.05]。另外，MSCs還可促進(jìn)PMA刺激的PBLs分泌IL-4、IL-10、IFN-γ3種細(xì)胞因子，某些情況下hUC-MSCs的促進(jìn)作用強(qiáng)于hBM-MSCs；而IFN-γ的上調(diào)，尚與多數(shù)研究矛盾，有待進(jìn)一步探