細胞因子誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞向平滑肌細胞分化的實驗研究.pdf

1、第一部分人脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)的體外分離、培養(yǎng)、鑒定及其生物學特性的觀察 目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定ADMSCs并對其生物學特性進行觀察。 方法：采用酶消化法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)ADMSCs并進行傳代擴增，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學特點，用透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)，用四氮唑藍比色法繪制細胞生長曲線，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD44、CD31和CD34的表達及細胞周期。 結(jié)果：

2、 1．原代培養(yǎng)的ADMSCs光鏡下形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)傳代純化后細胞形態(tài)呈均一梭形生長，透射電鏡示細胞較為幼稚、核大、核仁較為明顯，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，細胞器少且結(jié)構(gòu)和種類簡單。 2．流式細胞儀檢測顯示第1代、第3代和第5代ADMSCs均高表達CD29和CD44，而第1代、第3代和第5代ADMSCs均不表達CD31，CD34在第1代和第3代ADMSCs呈弱陽性表達，第5代時轉(zhuǎn)為隱性。 3．流式細胞儀檢測結(jié)果顯示已純化

3、的ADMSCs中G0/G1、S、G2/M的細胞分別占90.14％、3.77％和6.09％，提示只有少部分細胞處于對數(shù)增殖期，而大多數(shù)細胞處于靜止期。 4．ADMSCs生長曲線呈“S”形，第1天至第3天為細胞生長潛伏期，第4天開始進入對數(shù)生長期，第10天達頂點。 第二部分細胞因子體外誘導ADMSCs向平滑肌細胞的分化 目的：體外利用細胞因子誘導ADMSCs向平滑肌細胞的分化。 方法：利用不同的細胞因子誘導A

4、DMSCs向平滑肌細胞的分化。采用免疫熒光法檢測胞漿α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)對平滑肌細胞進行鑒定并計算其誘導率，實驗分為三組：(1)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細胞密度接種于預先置有蓋玻片的6孔板中，分為三個不同濃度的TGF-β誘導組和一個對照組，誘導組中分別添加TGF-β終濃度為1ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml；對照組中不添加TGF-β。(2)血小板衍生生長

5、因子-BB(PDGF-BB)誘導組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細胞密度接種于預先置有蓋玻片的6孔板中，分為三個不同濃度的PDGF-BB誘導組和一個對照組，誘導組分別添加PDGF-BB終濃度為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；對照組中不添加PDGF-BB。(3)聯(lián)合細胞因子誘導組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細胞密度接種于預先置有蓋玻片的6孔板中，分為一個誘導組和一個對照組，誘導組

6、聯(lián)合添加TGF-β和PDGF-BB，兩種細胞因子的濃度分別取前兩組實驗的最佳誘導濃度；對照組中不添加任何細胞因子。各組均于14d后結(jié)束培養(yǎng)，進行免疫熒光鑒定并計算每孔的誘導率[1]，選取最佳的誘導方法，用倒置相差顯微鏡觀察誘導后細胞的形態(tài)學特點，用透射電鏡觀察誘導后細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，用RT-PCR技術檢測平滑肌細胞胞漿蛋白SMcalponin、SMMHC、SM22αmRNA的表達，對平滑肌細胞進行進一步的鑒定。 結(jié)果：

7、 1．光鏡下觀察經(jīng)誘導后的細胞變得更狹長，由成纖維細胞狀變?yōu)殚L梭狀，胞膜清晰，無空泡，可重疊生長，融合后細胞形成“峰”和“谷”狀，呈良好的去分化狀態(tài)。免疫熒光法檢測經(jīng)誘導14d后部分細胞α-SMA表達陽性，說明有部分細胞分化為平滑肌細胞，而對照組中未發(fā)現(xiàn)α-SMA表達陽性的細胞。 2．免疫熒光結(jié)果顯示，在TGF-β誘導組，5ng/ml劑量組誘導效率最高。在PDGF-BB誘導組，20ng/ml劑量組誘導效率最高。聯(lián)合使用5ng/m

8、l TGF-β和20ng/mlPDGF-BB誘導效率高于單獨使用20ng/mlPDGF-BB劑量組，但低于單獨使用5ng/ml TGF-β劑量組。在所有實驗組中，誘導效率最高為5ng/ml TGF-β劑量組。 3．透射電鏡觀察顯示誘導后的細胞胞漿內(nèi)可見肌絲結(jié)構(gòu)，周圍細胞器較未誘導組的ADMSCs明顯增多，可見核糖體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細胞器，細胞器較未誘導組的ADMSCs更加發(fā)達。 4．RT-PCR結(jié)果顯示誘導后的