細(xì)胞因子誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)的體外分離、培養(yǎng)、鑒定及其生物學(xué)特性的觀察 目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定ADMSCs并對其生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。 方法：采用酶消化法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)ADMSCs并進(jìn)行傳代擴(kuò)增，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，用四氮唑藍(lán)比色法繪制細(xì)胞生長曲線，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD31和CD34的表達(dá)及細(xì)胞周期。 結(jié)果：

2、 1．原代培養(yǎng)的ADMSCs光鏡下形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)傳代純化后細(xì)胞形態(tài)呈均一梭形生長，透射電鏡示細(xì)胞較為幼稚、核大、核仁較為明顯，常染色質(zhì)多，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器少且結(jié)構(gòu)和種類簡單。 2．流式細(xì)胞儀檢測顯示第1代、第3代和第5代ADMSCs均高表達(dá)CD29和CD44，而第1代、第3代和第5代ADMSCs均不表達(dá)CD31，CD34在第1代和第3代ADMSCs呈弱陽性表達(dá)，第5代時轉(zhuǎn)為隱性。 3．流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示已純化

3、的ADMSCs中G0/G1、S、G2/M的細(xì)胞分別占90.14％、3.77％和6.09％，提示只有少部分細(xì)胞處于對數(shù)增殖期，而大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期。 4．ADMSCs生長曲線呈“S”形，第1天至第3天為細(xì)胞生長潛伏期，第4天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，第10天達(dá)頂點(diǎn)。 第二部分細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)ADMSCs向平滑肌細(xì)胞的分化 目的：體外利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)ADMSCs向平滑肌細(xì)胞的分化。 方法：利用不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)A

4、DMSCs向平滑肌細(xì)胞的分化。采用免疫熒光法檢測胞漿α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)對平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定并計(jì)算其誘導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)分為三組：(1)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細(xì)胞密度接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板中，分為三個不同濃度的TGF-β誘導(dǎo)組和一個對照組，誘導(dǎo)組中分別添加TGF-β終濃度為1ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml；對照組中不添加TGF-β。(2)血小板衍生生長

5、因子-BB(PDGF-BB)誘導(dǎo)組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細(xì)胞密度接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板中，分為三個不同濃度的PDGF-BB誘導(dǎo)組和一個對照組，誘導(dǎo)組分別添加PDGF-BB終濃度為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；對照組中不添加PDGF-BB。(3)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)組：取已純化的第3代ADMSCs，以2×103/cm2細(xì)胞密度接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板中，分為一個誘導(dǎo)組和一個對照組，誘導(dǎo)組

6、聯(lián)合添加TGF-β和PDGF-BB，兩種細(xì)胞因子的濃度分別取前兩組實(shí)驗(yàn)的最佳誘導(dǎo)濃度；對照組中不添加任何細(xì)胞因子。各組均于14d后結(jié)束培養(yǎng)，進(jìn)行免疫熒光鑒定并計(jì)算每孔的誘導(dǎo)率[1]，選取最佳的誘導(dǎo)方法，用倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，用透射電鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，用RT-PCR技術(shù)檢測平滑肌細(xì)胞胞漿蛋白SMcalponin、SMMHC、SM22αmRNA的表達(dá)，對平滑肌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。 結(jié)果：

7、 1．光鏡下觀察經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞變得更狹長，由成纖維細(xì)胞狀變?yōu)殚L梭狀，胞膜清晰，無空泡，可重疊生長，融合后細(xì)胞形成“峰”和“谷”狀，呈良好的去分化狀態(tài)。免疫熒光法檢測經(jīng)誘導(dǎo)14d后部分細(xì)胞α-SMA表達(dá)陽性，說明有部分細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，而對照組中未發(fā)現(xiàn)α-SMA表達(dá)陽性的細(xì)胞。 2．免疫熒光結(jié)果顯示，在TGF-β誘導(dǎo)組，5ng/ml劑量組誘導(dǎo)效率最高。在PDGF-BB誘導(dǎo)組，20ng/ml劑量組誘導(dǎo)效率最高。聯(lián)合使用5ng/m

8、l TGF-β和20ng/mlPDGF-BB誘導(dǎo)效率高于單獨(dú)使用20ng/mlPDGF-BB劑量組，但低于單獨(dú)使用5ng/ml TGF-β劑量組。在所有實(shí)驗(yàn)組中，誘導(dǎo)效率最高為5ng/ml TGF-β劑量組。 3．透射電鏡觀察顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞胞漿內(nèi)可見肌絲結(jié)構(gòu)，周圍細(xì)胞器較未誘導(dǎo)組的ADMSCs明顯增多，可見核糖體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細(xì)胞器，細(xì)胞器較未誘導(dǎo)組的ADMSCs更加發(fā)達(dá)。 4．RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的