人羊膜間充質(zhì)細胞誘導(dǎo)成骨修復(fù)兔牙槽突裂的實驗研究.pdf

1、目的：通過對人羊膜間充質(zhì)細胞(hAMCs)體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞，經(jīng)明膠海綿搭載移植修復(fù)兔牙槽突裂，為牙槽突裂組織工程修復(fù)尋找理想的種子細胞來源。
　　 方法：采用手術(shù)方式在兔上頜骨制造一個1.0 cm×0.5cm楔狀缺損，建立兔雙側(cè)牙槽突裂模型。采用機械法和酶分離法從人羊膜組織中分離出hAMCs，并進行體外培養(yǎng)，第三代細胞用流式細胞儀(FCM)分別檢測表面分子CD44、CD29、CD45、CD34、CD166和CD71的表達情

2、況，并采用免疫細胞化學(xué)方法檢測波形蛋白進行細胞表型鑒定。對鑒定為hAMCs的第三代細胞加入DEX、VitC和β-GP進行定向誘導(dǎo)，使其向成骨細胞分化，21天后用茜素紅S檢測鈣鹽沉積判定其是否向成骨細胞分化。將認定分化成成骨細胞者應(yīng)用到動物實驗中。根據(jù)移植物的不同將建立的牙槽突裂兔隨機分為A組(hAMCs與明膠海綿復(fù)合體；n=12)、B組(經(jīng)誘導(dǎo)后hAMCs與明膠海綿復(fù)合體；n=12)、C組(單純明膠海綿移植；n=12)，D組(空白對照；

3、n=4)。于移植后2w、4w、6w、8w、12w處死各實驗組2只實驗動物，D組實驗結(jié)束時一并處死。對移植區(qū)牙槽骨的厚度進行測量，常規(guī)HE染色及免疫組化染色以觀察移植區(qū)新骨形成及細胞存活情況。
　　 結(jié)果：①第三代的hAMCs呈長梭形，漩渦樣生長，表達CD29、CD166、CD44、CD73、波形蛋白，不表達CD34、CD45，并能很好的粘附生長于膠原一明膠海綿上；②經(jīng)地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉，誘導(dǎo)21天后可檢測出茜素紅

4、染色陽性的鈣結(jié)節(jié)；③經(jīng)手術(shù)移植后2w、4w、6w、8w、12w處死各實驗組2只兔，12w大體標本示：A、B兩組牙槽突缺損處大量骨質(zhì)沉積，缺損處得以修復(fù)，C組：骨面粗糙，缺損處有骨質(zhì)充填，缺損變小，變淺；D組：缺損變小，內(nèi)側(cè)見薄層骨質(zhì)充填，中切牙牙根暴露或僅有少許骨質(zhì)包繞。12w后在移植區(qū)牙槽骨厚度比較，A與B組，P>0.05；A與C、D組比較，P<0.05，B與C、D組比較P<0.05，C與D比較P<0.05。④ HE染色：A，B兩組在

5、術(shù)后2W可見成骨細胞聚集區(qū)，但B組出現(xiàn)鈣鹽沉積較A組早，C組各個時期均未發(fā)現(xiàn)成骨細胞聚集區(qū)。⑤移植后12周A組與B組經(jīng)免疫組化檢測到抗人細胞核抗體的細胞存在，C、D組未檢測到抗人細胞核抗體的細胞。
　　 結(jié)論：1、hAMCs表達典型的間充質(zhì)干細胞的表面標志，可以在體外誘導(dǎo)成骨；
　　 2、hAMCs及誘導(dǎo)成骨后都可以很好的生長于膠原-明膠海綿；
　　 3、hAMCs及成骨誘導(dǎo)后的hAMCs均可在體內(nèi)成活；