人肝細(xì)胞生長因子基因修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：肝纖維化(hepatic fibrosis)是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的重要中間環(huán)節(jié),目前認(rèn)為,這個階段的肝臟病變是可逆的,但若沒有及時有效治療,則最終發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化、甚至肝癌。細(xì)胞移植成為治療肝纖維化的新策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemesenchymal stem cells,BMSCs)具有自我更新能力,在合適的微環(huán)境里可多系橫向分化,可以被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞修復(fù)損傷肝組織。肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte grow

2、m factor,HGF)是一種具有較強的抗纖維化和抗凋亡活性的多功能因子,參與機體多種器官組織的生長、再生和重塑等過程。HGF可以調(diào)控BMSCs向肝細(xì)胞分化,促進肝細(xì)胞增殖。關(guān)于HGF基因修飾BMSCs是否促進誘導(dǎo)其向肝樣細(xì)胞分化,目前國內(nèi)外尚未見報道。本實驗構(gòu)建了HGF基因的真核表達載體,利用HGF基因轉(zhuǎn)染BMSCs對其進行基因修飾。研究HGF表達或增強其表達后對誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化的影響,為進一步研究HGF基因及BMSCs

3、治療肝纖維化及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴Percoll密度梯度離心法聯(lián)合貼壁法從成人骨髓血中分離BMSCs,第4代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD29、CD44、CD105及CD415表達率;成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定多向分化能力。⑵通過PCR從Pblast2-hHGF質(zhì)粒擴增hHGF基因片段,利用基因重組技術(shù),構(gòu)建編碼hHGF基因的真核表達載體pEGFP-N1-hHGF。雙酶切及測序鑒定重組載體。⑶利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

4、,將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-hHGF轉(zhuǎn)染人BMSCs。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的情況及轉(zhuǎn)染率。RT-PCR及WesternBlot檢測hHGF基因的表達。MTT檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活力。⑷用酒精性肝硬化患者血清誘導(dǎo)hHGF修飾過的BMSCs,Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(ALB)的表達。
　　 結(jié)果：①第4代BMSCs高表達CD29、CD105、CD44,不表達CD45。成脂誘導(dǎo)2周,油紅O染色顯示誘導(dǎo)

5、細(xì)胞內(nèi)紅染的脂滴。成骨誘導(dǎo)2周,茜素紅染色見橘紅色的鈣鹽沉積。②PCR獲得了hHGF基因片段(約2184bD),測序結(jié)果與Gene bank上已知序列行BLAST分析,同源性達100％。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定構(gòu)建正確。③轉(zhuǎn)染48h后pEGFP-N1/hHGF轉(zhuǎn)染組及pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率分別為38.2±2.1%和42.2±3.5%。RT-PCR及Western Blot檢測到有hHGF的表達。MTT結(jié)果提示轉(zhuǎn)染hHGF基因使細(xì)