端粒酶逆轉錄酶基因修飾人骨髓間充質干細胞的實驗研究.pdf

1、7 b 鴨h @ 8 2 ＼0 0 莖蒜霎霉嵩密 級 公開鄭州 大學碩士學位論文論文題目：作者姓名：學科門類：專業(yè)名稱：導師姓名、職稱：端粒酶逆轉錄酶基因修飾人骨髓間充質干細胞的實驗研究李 克醫(yī) 學生理學邢瑩教授二零零五年五月二十五日塑型查蘭! ! 墮蘭堡主型窒生望些熊奎 塑塹墮望壁墨墼苧墮壁銎△堂塑囹壟．墾王塑盟莖墮里墮目的：觀察外源性h T E R T 基因的異位表達對人骨髓間充質= l = 細胞( m e s e n c h y

2、m a ls t e mc e l l ，M S C ) 端粒酶活性及細胞生命周期的影響。方法：1 ．將攜帶有增強型綠色熒光蛋l(fā) ! 芻( e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，E G F P ) 報告基因和人端粒酶逆轉錄酶( h u m a n t e l o m e r a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t

3、 a s e ，h T E R T ) 目的基因的質粒D E G F P ．h T E R T 通過脂質體轉染法轉入人骨髓M S C s 中，并用G 4 1 8 進行陽性克隆的篩選和擴增。2 ．通過R T - P C R 和P C R - E L I S A 對轉染前后h T E R T m R N A 的表達情況及其對端粒酶活性的影響進行檢測，并對轉染細胞的染色體核型進行分析。3 ．將轉染細胞在重組人E G F 和b F G F 的聯(lián)

4、合誘導下向神經(jīng)元樣細胞定向誘導分化，并用R T - P C R 進行鑒定。結果：1 ．轉染3 6 h 在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光并持續(xù)1 個月以上。通過R T - P C R 檢測表明，未轉染的入骨髓M S C s 的h T E R T m R N A 表達陰性，而轉h T E R T 的入M S C s 的h T E R T m R N A 表達陽性，通過P C R - E L I S A 檢測表明，未轉染的人骨髓M S C s 的

5、端粒酶為陰性，而轉染h T E R T 的人骨髓M S C s 的端粒酶則呈陽性。2 ．轉染h T E R T 的人骨髓M S C s 在體外已連續(xù)傳到第3 5 代且保持正常二倍體核型，而未轉染的人骨髓M S C s 傳到第2 0 ～2 5 代左右已衰老死亡。3 ．轉染h T E R T 的人骨髓M S C s 經(jīng)E G F 和b F G F 的聯(lián)合誘導后，較多細胞出現(xiàn)了典型的神經(jīng)元樣形態(tài)，且經(jīng)R T - P C R 檢測表明，神經(jīng)元特

6、征性蛋白微管相關蛋白( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e p r o t e i n ，M A P 2 ) 和神經(jīng)絲亞單位M ( n e u r o f l i a m e n ts u b u n i t M ，N F - M )表達增強。結論：1 ．外源性h T E R T 基因可以在人骨髓間充質干細胞中獲得異位表達，并能誘導人骨髓問充質干細胞的端粒酶活性。2 ．外源性h T E R T