人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)促胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞染色體末端含有一個(gè)TTAGGG的重復(fù)序列，這些末端DNA重復(fù)序列被命名為端粒，生理穩(wěn)態(tài)時(shí)隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，染色體端粒長(zhǎng)度會(huì)逐漸縮短最終導(dǎo)致細(xì)胞的衰老。端粒酶是維持端粒延伸和長(zhǎng)度穩(wěn)定的關(guān)鍵酶，腫瘤細(xì)胞端粒酶持續(xù)高表達(dá)和活化而導(dǎo)致細(xì)胞具有無(wú)限增殖及永生化的特性。端粒酶是一種核糖核蛋白，包含有RNA及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，通過(guò)RNA模板合成特異性的TTAGGG重復(fù)序列以維持端粒的長(zhǎng)度的穩(wěn)定。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human

2、telomerase reverse transcriptase, hTERT)作為端粒酶的催化亞單位，在端粒酶的活化中發(fā)揮決定性的作用，hTERT的表達(dá)即可代表端粒酶的活化。hTERT在90％以上的人類惡性腫瘤中高水平表達(dá)，可通過(guò)發(fā)揮其經(jīng)典的逆轉(zhuǎn)錄酶活性促進(jìn)腫瘤的無(wú)限增殖，而越來(lái)越多的研究表明，hTERT亦可通過(guò)非依賴逆轉(zhuǎn)錄酶活性而參與多種基因的表達(dá)調(diào)控。
　　我國(guó)作為胃癌的高發(fā)國(guó)家，胃癌發(fā)病率在男性和女性分別列第二和第三位，而

3、致死率已躍居所有惡性腫瘤的第二位。早期侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因，但目前針對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并不十分清楚。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要包括細(xì)胞粘附能力改變、細(xì)胞外基質(zhì)的降解、EMT及腫瘤血管生成等。肝素酶(Heparanase)作為唯一能降解細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的內(nèi)切酶，可破壞細(xì)胞外基質(zhì)屏障并促進(jìn)錨定的多種細(xì)胞因子釋放，從而參與多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控。肝素酶在腫瘤組織及患者血清中高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及新生血

4、管密度密切相關(guān)，抑制肝素酶表達(dá)可明顯抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，提示肝素酶是具有潛在價(jià)值的抗腫瘤靶標(biāo)。
　　過(guò)去的研究主要關(guān)注于hTERT在腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖中的作用，隨著研究的深入，hTERT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制亦逐漸被揭示。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)hTERT可明顯增強(qiáng)細(xì)胞的體外侵襲能力，并且胃癌組織hTERT的表達(dá)與胃癌大小、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示hTERT可能參與了胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控，然而具體的調(diào)控機(jī)制不清。本研究

5、擬闡明hTERT調(diào)控胃癌細(xì)胞肝素酶表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及分子機(jī)制，為以hTERT為靶點(diǎn)的胃癌診斷及治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.體外侵襲及體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，證實(shí)hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用;
　　2.采用雙熒光素酶、qPCR及western blot檢測(cè)hTERT對(duì)肝素酶啟動(dòng)子活性、mRNA及蛋白表達(dá)的影響，證實(shí)hTERT可調(diào)控肝素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá);
　　3.生物信息學(xué)及qPCR實(shí)驗(yàn)篩選

6、確定介導(dǎo)hTERT調(diào)控肝素酶表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子;
　　4.雙熒光素酶及western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾c-Myc對(duì)肝素酶啟動(dòng)子活性和蛋白表達(dá)的影響，并利用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-Myc與肝素酶啟動(dòng)子結(jié)合情況，證實(shí)c-Myc可通過(guò)結(jié)合肝素酶啟動(dòng)子而調(diào)控肝素酶轉(zhuǎn)錄表達(dá);
　　5.突變肝素酶啟動(dòng)子的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)或干擾c-Myc表達(dá)，分別用雙熒光素酶及western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT對(duì)肝素酶啟動(dòng)子活性和蛋白表達(dá)

7、的影響，進(jìn)一步證實(shí)c-Myc可介導(dǎo)hTERT對(duì)肝素酶的表達(dá)調(diào)控;
　　6.采用免疫共沉淀(Co-IP)、免疫熒光共定位、ChIP及re-ChIP實(shí)驗(yàn)，證實(shí)hTERT可與c-Myc形成復(fù)合物并通過(guò)c-Myc結(jié)合于肝素酶啟動(dòng)子區(qū);
　　7.分別干擾或過(guò)表達(dá)hTERT及c-Myc，通過(guò)雙熒光素酶及western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝素酶啟動(dòng)子活性和蛋白表達(dá)，證實(shí)兩者是肝素酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)激活的必須調(diào)控分子;
　　8.采用TOP/FO

8、P實(shí)驗(yàn)、免疫熒光及western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)hTERT可促進(jìn)β-catenin核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活化，進(jìn)一步通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)c-Myc的表達(dá)上調(diào)，證實(shí)hTERT與c-Myc存在相互調(diào)控的反饋通路;
　　9.體外侵襲及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾肝素酶表達(dá)對(duì)hTERT調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，證實(shí)hTERT通過(guò)上調(diào)肝素酶表達(dá)促胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用;
　　10.免疫組化檢測(cè)hTERT、c-Myc及肝素酶在胃癌

9、及癌旁組織的表達(dá)情況，分析三者表達(dá)的相關(guān)性及與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.體外侵襲及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)或抑制胃癌細(xì)胞hTERT表達(dá)可促進(jìn)或抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移;
　　2.雙熒光素酶、qPCR及western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)或抑制hTERT表達(dá)可上調(diào)或抑制hTERT的啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提示hTERT可調(diào)控肝素酶表達(dá)并與肝素酶的轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān);
　　3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、

10、雙熒光素酶及qPCR初步篩選發(fā)現(xiàn)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc表達(dá)可抑制hTERT誘導(dǎo)的肝素酶啟動(dòng)子活性和mRNA的表達(dá)上調(diào)，提示c-Myc可能參與了hTERT對(duì)肝素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控;
　　4.ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Myc可直接與肝素酶啟動(dòng)子結(jié)合，而突變肝素酶啟動(dòng)子區(qū)的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)，可明顯抑制hTERT對(duì)肝素酶啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用，提示hTERT通過(guò)c-Myc結(jié)合肝素酶啟動(dòng)子而調(diào)控肝素酶轉(zhuǎn)錄表達(dá);
　　5.Co-IP及免疫熒

11、光實(shí)驗(yàn)證實(shí)hTERT與c-Myc在胃癌細(xì)胞核中存在共定位和相互作用，ChIP及reChIP實(shí)驗(yàn)表明，hTERT與c-Myc形成的復(fù)合物可通過(guò)c-Myc與肝素酶啟動(dòng)子結(jié)合，并且過(guò)表達(dá)hTERT可促進(jìn)復(fù)合物的形成及復(fù)合物與肝素酶啟動(dòng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)肝素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào);
　　6.在過(guò)表達(dá)hTERT或c-Myc同時(shí)分別干擾c-Myc或hTERT的表達(dá)，可明顯抑制過(guò)表達(dá)hTERT或c-Myc誘導(dǎo)的肝素酶啟動(dòng)子活性及蛋白表達(dá)，而同時(shí)過(guò)表達(dá)

12、hTERT和c-Myc可促進(jìn)更高的肝素酶啟動(dòng)子活性和蛋白表達(dá)水平，提示hTERT與c-Myc形成的完整復(fù)合物在肝素酶轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用;
　　7.hTERT可促進(jìn)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hTERT可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)下游基因c-Myc的表達(dá)上調(diào)。既往研究表明，c-Myc可直接結(jié)合于hTERT的啟動(dòng)子而促進(jìn)hTERT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提示hTERT與c-Myc間存在相互調(diào)控而形成正

13、向反饋調(diào)控通路維持兩者在胃癌細(xì)胞的高表達(dá)和肝素酶的持續(xù)表達(dá)上調(diào);
　　8.干擾c-Myc或肝素酶表達(dá)可明顯抑制hTERT促胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示hTERT可通過(guò)與c-Myc協(xié)同促胃癌細(xì)胞肝素酶表達(dá)上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移;
　　9.胃癌組織免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hTERT、c-Myc及肝素酶在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且三者在胃癌中的表達(dá)存在明顯的正相關(guān)，生存分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。
　

14、　結(jié)論：
　　通過(guò)以上研究，我們證實(shí)了hTERT在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的重要調(diào)控作用，并發(fā)現(xiàn)hTERT可通過(guò)上調(diào)胃癌細(xì)胞肝素酶表達(dá)而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，hTERT可作為輔助活化因子與核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，該復(fù)合物可通過(guò)c-Myc直接與肝素酶啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)肝素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在該調(diào)控機(jī)制中，hTERT可通過(guò)活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)c-Myc的表達(dá)上調(diào)，而c-Myc亦可作用于hTERT