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文檔簡介
1、腫瘤細胞的形成與端粒酶活性有著較高的相關(guān)性，利用端粒酶為靶點來進行腫瘤基因治療以及控制干細胞移植過程中的瘤變問題，其關(guān)鍵在于獲取一種具有高度轉(zhuǎn)錄特異性及轉(zhuǎn)錄頻率的人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)基因啟動子片段。然而天然hTERT啟動子在轉(zhuǎn)錄活性與特異性方面不夠理想，為獲取一種在端粒酶表達陽性細胞中具有高特異性和較強轉(zhuǎn)錄活性的hTERT基因啟動子，我們以天然hTE
2、RT基因編碼序列啟始子ATG上游270bp堿基序列為基本框架結(jié)構(gòu)，進行啟動子重組設(shè)計，在其下游接入四個E—box(CACGTG)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，用化學(xué)合成法將該序列進行人工合成并亞克隆入PUC57克隆載體中；構(gòu)建表達增強型綠色熒光蛋白 (enhanced green fluorescentprotein，eGFP)報告基因的慢病毒載體，并用重組的hTERT基因啟動子片段取代慢病毒載體eGFP上游的巨細胞病毒(cytomegalovirus
3、，CMV)啟動子；將新得到的重組慢病毒載體用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入端粒酶陽性的人胚腎上皮腫瘤細胞(293FT)、肝癌細胞(HepGⅡ)、胃癌細胞(SGC7901)及端粒酶陰性的人骨肉瘤細胞(U2OS)中進行功能鑒定；為進一步驗證重組hTERT基因啟動子在正常細胞中的轉(zhuǎn)錄活性及特異性，將重組慢病毒載體包裝成病毒顆粒后感染原代培養(yǎng)的人成纖維細胞，并用激光共聚焦顯微鏡檢測報告基因的表達。實驗結(jié)果顯示：在293FT、HepGⅡ、SGC7901細胞中均
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