一種人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子的重組與功能鑒定.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的形成與端粒酶活性有著較高的相關(guān)性，利用端粒酶為靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)行腫瘤基因治療以及控制干細(xì)胞移植過(guò)程中的瘤變問(wèn)題，其關(guān)鍵在于獲取一種具有高度轉(zhuǎn)錄特異性及轉(zhuǎn)錄頻率的人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)基因啟動(dòng)子片段。然而天然hTERT啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄活性與特異性方面不夠理想，為獲取一種在端粒酶表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞中具有高特異性和較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的hTERT基因啟動(dòng)子，我們以天然hTE

2、RT基因編碼序列啟始子ATG上游270bp堿基序列為基本框架結(jié)構(gòu)，進(jìn)行啟動(dòng)子重組設(shè)計(jì)，在其下游接入四個(gè)E—box(CACGTG)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，用化學(xué)合成法將該序列進(jìn)行人工合成并亞克隆入PUC57克隆載體中；構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (enhanced green fluorescentprotein，eGFP)報(bào)告基因的慢病毒載體，并用重組的hTERT基因啟動(dòng)子片段取代慢病毒載體eGFP上游的巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus

3、，CMV)啟動(dòng)子；將新得到的重組慢病毒載體用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入端粒酶陽(yáng)性的人胚腎上皮腫瘤細(xì)胞(293FT)、肝癌細(xì)胞(HepGⅡ)、胃癌細(xì)胞(SGC7901)及端粒酶陰性的人骨肉瘤細(xì)胞(U2OS)中進(jìn)行功能鑒定；為進(jìn)一步驗(yàn)證重組hTERT基因啟動(dòng)子在正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性及特異性，將重組慢病毒載體包裝成病毒顆粒后感染原代培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞，并用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在293FT、HepGⅡ、SGC7901細(xì)胞中均