人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組腺病毒治療人前列腺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：前列腺癌在歐美國(guó)家中發(fā)病率很高，死亡率居第二位，儀次于肺癌。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也在逐年升高。盡管絕大多數(shù)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺癌，初始對(duì)雄激素撤除有效，但最終預(yù)后不佳，而導(dǎo)致治療失敗。近年來(lái)隨著分子機(jī)制研究的深入，基因療法為前列腺癌尤其是那些雄激素非依賴(lài)性前列腺癌的治療提供一條新途徑。自殺基因治療是一種有前景的基因治療方法，常用的為單純皰疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HS

2、V-tk)基因。其機(jī)理為基因編碼的胸腺嘧啶核苷激酶將無(wú)毒的環(huán)氧鳥(niǎo)苷(gancyclovir，GCV)磷酸化，干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。然而缺乏殺傷腫瘤特異性，是現(xiàn)今許多基因治療方案所面臨的一個(gè)共同問(wèn)題，因此研發(fā)出具有腫瘤靶向機(jī)制的治療方法顯得非常必要。端粒酶在大多惡性腫瘤細(xì)胞中處于激活狀態(tài)而在正常細(xì)胞中卻沒(méi)有活性或者活性很低，是目前所報(bào)道最為廣譜的腫瘤生物分子標(biāo)記。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasetra

3、nscriptase，hTERT)是維持端粒酶活性所必需的催化亞單位，它的表達(dá)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平上。利用hTERT啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控病毒攜帶的目的基因，可使病毒選擇性的在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)目的基因。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)腺病毒載體嵌入hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)的HSV-tk基因，重組構(gòu)建Ad-hTERT-HSV-tk，結(jié)合應(yīng)用GCV，對(duì)裸鼠移植性前列腺癌進(jìn)行治療，從而將HSV-tk基因選擇性地導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞，并能把GCV轉(zhuǎn)化為毒性代謝物——三磷酸丙

4、氧鳥(niǎo)苷，其作為鏈的終止劑，干擾細(xì)胞分裂時(shí)DNA的合成，最終導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞阻抑或死亡而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。從而體現(xiàn)該治療系統(tǒng)的安全性、有效性以及靶向性。 方法：于裸鼠右前背部皮下接種5×107個(gè)/mlLNCaP細(xì)胞懸液0.1m1，建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型。待成瘤約50mm3后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分組以及給藥方式如下：A組，空白對(duì)照，不給藥；B組，Ad-hTERT-HSV-tk對(duì)照組，經(jīng)尾靜脈注射5.0×10

5、9Pfu/ml重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk0.1ml，第1，5，10天各1次，第2～15天腹腔注射PBS0.1ml；C組，GCV對(duì)照組，經(jīng)尾靜脈注射PBS0.1ml，第1，5，10天各1次，第2～15天腹腔注射GCV50mg/kg；D組，治療組，經(jīng)尾靜脈注射Ad-hTERT-HSV-tk同B組，腹腔注射GCV同C組。觀察腫瘤體積、重量、抑制率、體積-時(shí)間曲線以及裸鼠生存期。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取前列腺腫瘤組織制備石蠟切片進(jìn)行HE染色

6、，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)法、TUNEL法及透射電鏡檢查檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡，免疫組化染色檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原，測(cè)定增殖指數(shù)。 結(jié)果：在作用底物GCV存在條件下，Ad-hTERT-HSV-tk對(duì)裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，在整個(gè)觀察期內(nèi)，Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的腫瘤體積均明顯小于對(duì)照組(P＜0.05)，對(duì)照組各組之間相比無(wú)顯著性差異；比較切除腫瘤標(biāo)本的重量，可發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的移植瘤重量明顯

7、輕于對(duì)照組(P=0.000137)，也明顯輕于Ad-hTERT-HSV-tk和GCV治療組(P值分別為0.000338和0.000467)；病理檢查發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的腫瘤細(xì)胞稀疏分散排列，腫瘤血管明顯減少，組織結(jié)構(gòu)紊亂，多為纖維組織所代替，呈退化表現(xiàn)。治療結(jié)束后，取心、肺、肝組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，與正常對(duì)照的心、肺、肝組織相比無(wú)顯著差別；Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組流式細(xì)胞學(xué)法測(cè)得的細(xì)胞周期

8、中G1/S期細(xì)胞數(shù)平均占84％，明顯高于對(duì)照組，而G2/M期細(xì)胞卻明顯低于對(duì)照組，流式細(xì)胞技術(shù)及TUNEL法測(cè)定治療組的凋亡率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，透射電鏡可檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞凋亡，另外免疫組化法測(cè)定的增殖指數(shù)，治療組明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。 結(jié)論：Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)能夠明顯抑制裸鼠前列腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，治療組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速率明顯慢于對(duì)照組，具有明顯的量-效曲線，而且裸鼠的生存期顯著延長(zhǎng)。