TGF-β1對大鼠肝星狀細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的：分離純化大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)并進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)對大鼠肝星狀細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)酶表達(dá)的影響，探討轉(zhuǎn)化生長因子β1在肝纖維化中的作用及其機(jī)制。
　　 方法：采用鏈霉蛋白酶E、IV型膠原酶原位灌注和振蕩消化離體的大鼠肝臟；分別以Percoll液和Nycodenz液的非連續(xù)密度梯度離心分離純

2、化HSCs；細(xì)胞計數(shù)板法計算細(xì)胞得率；臺盼藍(lán)染色法顯示細(xì)胞存活率；Desmin鑒定細(xì)胞純度。首先，MTT比色法檢測TGF-β1對HSCs增殖的影響。然后按照下述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。方法一：將原代分離的HSCs細(xì)胞分為三組：(1)TGF-β1處理3天組以及對照組；(2)TGF-β1處理6天組以及對照組；(3)TGF-β1處理9天組以及對照組，半定量反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒?RT-PCR)檢測各組TERT mRNA的表達(dá)。方法二：原代分離的HSCs細(xì)

3、胞培養(yǎng)6天后，將HSCs分為四組，分別加入不同濃度的TGF-β1：(1)0ng/ml TGF-β1組；(2)0.1ng/mlTGF-β1組；(3)1ng/ml TGF-β1組；(4)10ng/ml TGF-β1組，24小時后，半定量RT-PCR檢測各組TERT mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用Percoll液和Nycodenz液體外分離純化大鼠肝HSCs，Nycodenz液體外分離純化法分別在細(xì)胞得率，還是

4、在細(xì)胞存活率、細(xì)胞純度方面均優(yōu)于前者。本研究建立一種簡便、高效的大鼠肝星狀細(xì)胞分離方法。新分離的細(xì)胞培養(yǎng)3個小時后在熒光顯微鏡328nm波長的紫外光激發(fā)下，可觀察到極容易淬滅的藍(lán)色的自發(fā)熒光；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞Desmin蛋白與α-SMA(α-smoothmuscle actin)陽性，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞是HSCs。分離培養(yǎng)的大鼠原代HSCs活率在90％以上，純度超過90％。
　　 2.TGF-β1在(1-20)ng

5、/ml濃度范圍內(nèi)，對原代培養(yǎng)6天的HSCs分別作用12小時、24小時后，隨著TGF-β1濃度的增加，OD值沒有明顯的變化，其差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.隨著時間的延長，原代培養(yǎng)的HSCs端粒酶逆轉(zhuǎn)酶的活性有增強(qiáng)的趨勢。
　　 4.1ng/ml TGF-β1對原代HSCs作用3天后，TERT與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值，處理組與正常對照組相比，其差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義；1ng/ml TGF-β1對原代HSCs作用6天

6、后，TERT與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值，處理組與正常對照組相比，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1ng/ml TGF-β1對原代HSCs作用9天后，細(xì)胞幾乎全部凋亡，無法與對照組相比較。
　　 5.0.1ng/ml TGF-β1作用原代HSCs24小時后，TERT與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值，處理組與正常對照組相比，其差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義；1ng/ml與10ng/ml TGF-β1分別作用原代HSCs24小時后