端粒酶逆轉錄酶C端重組質粒構建與表達及對細胞增殖和活力的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 端粒存在于真核生物線性染色體末端，其主要生物學功能是保護染色體末端，避免染色體末端被核酸酶降解，并有效防止染色體之間融合、重組和降解，在維持基因組的結構完整性和穩(wěn)定性上起到重要作用。在正常人體細胞中，端?？呻S著細胞分裂而逐漸縮短，隨著分裂次數增加，分裂多次的細胞染色體端粒越來越短。當縮短到一定程度時，染色體DNA將變得不再穩(wěn)定，細胞進入增殖衰竭期，螺旋解開，細胞繼續(xù)存活但不能再分裂，最終走向自然衰老或死亡

2、。
　　 人端粒酶是由人端粒酶RNA組分(hTR)，人端粒酶相關蛋白和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)三部分組成的蛋白質復合物。它能在缺少DNA模板的情況下，以自身RNA為模板通過逆轉錄不斷合成新的端粒重復序列，并連接到染色體端粒3'末端，彌補端粒丟失，從而阻止端粒的縮短，并可能使得細胞最終逃脫程序性死亡，獲得無限增殖能力，即細胞永生化。在大部分的腫瘤組織中均檢測到端粒酶活性，端粒酶活性與惡性腫瘤有著密切關系。這表明端粒酶的激活可

3、能是腫瘤發(fā)生過程中的關鍵因素。90％以上的惡性腫瘤細胞因為激活端粒酶，能把端?？s短的部分補上，細胞分裂后端粒并不縮短，這是腫瘤細胞永生化的重要前提條件，也使得端粒酶成為識別腫瘤細胞和正常細胞的6個重要標志之一。進一步的研究表明.端粒酶的表達水平與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后有著高度相關性。
　　 人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)作為人端粒酶的重要組成部分之一。hTERTmRNA與端粒酶活性相一致，所以hTERT是控制細胞端粒酶

4、活性的限制酶之一，對維持腫瘤細胞的生長非常重要，抑制端粒酶活性可以使細胞內的端粒正常地縮短長度。
　　 hTERT對端粒的延伸作用，乃至腫瘤的發(fā)生過程，不僅僅是簡單地激活端粒酶，而且還包括hTERT蛋白在胞漿和核仁之間的穿梭運輸機制。研究中證實hTERTC-端第965-981氨基序列所編碼的蛋白是介導hTERT核仁定位的一個必須的核仁定位信號。進一步研究中發(fā)現，第965-981氨基酸序列中富含保守的堿性氨基酸，該區(qū)域是決定hTE

5、RT核仁定位的關鍵信號。
　　 hTERT通過相關蛋白的作用與端粒DNA3'懸突端結合，使端粒引物末端剛好位于端粒酶RNA(TR)模板區(qū)的起始端，是使端粒不斷延伸的關鍵步驟。hTERT與端粒的結合部位主要是端粒DNA3'懸突端重復的(TTAGGG)n基因序列。有研究顯示hTERTC-端中的第963-972氨基酸序列、第993-1002氨基酸序列、第1047-1056氨基酸序列、第1077-1086氨基酸序列和第1108-1117

6、氨基酸序列所編碼的五個蛋白與端粒DNA3'懸突端重復序列存在蛋白結合活性，能夠與(TTAGGG)n重復序列形成蛋白質-DNA結合物。
　　 本文擬在hTERTC-端截取編碼第936-1132氨基酸的堿基序列，并命名為hTERTC197，該基因序列包括核仁定位信號（第965-981氨基酸）和與端粒DNA3'懸突端結合的氨基酸序列（第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸）

7、。將hTERTC197通過構建原核重組質粒和真核重組質粒，并分別在原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)表達該片段蛋白，為了探討hTERT在人類細胞內的定位與結合的情況提供前期的研究基礎。
　　 為了初步研究hTERTC197對人類癌細胞和永生化細胞的作用，將構建的真核重組質粒分別轉染人子宮癌Hela細胞和永生化的人胚腎293T細胞，采用MTT比色法檢測細胞增殖和細胞活力。
　　 方法和內容:
　　 1.hTERTC197原

8、核重組質粒構建與表達
　　 1.1外源基因片段的獲取
　　 通過引物設計軟件和原核表達載體多克隆位點區(qū)的特點設計PCR擴增引物，引物兩端分別引入特異性酶切位點BamHI和XhoI，以hTERTcDNA為模板擴增外源基因序列，并經過回收純化得到外源基因片段。
　　 1.2重組質粒的構建
　　 原核表達載體pEGX-4T-1和外源基因片段通過特異性內切酶BamHI和XhoI雙酶切，將得到的酶切產物通過T4連接

9、酶系統(tǒng)進行連接反應，所得連接產物轉化入大腸桿菌DH5α，構建轉化菌。提取原核重組質粒pEGX-4T-1-hTERTC197，并進行一系列鑒定，確定原核重組質粒的成功構建。
　　 1.3目的蛋白的誘導表達
　　 將成功構建的原核重組質粒轉化入宿主菌BL21(DE3)，并進行一系列鑒定確定工程菌的成功構建。采用IPTG誘導工程菌表達目的蛋白，提取細菌蛋白后，通過蛋白電泳和免疫印跡法檢測和鑒定目的蛋白表達情況。
　　

10、2.hTERTC197真核組質粒構建與表達
　　 2.1外源基因片段的獲取
　　 通過引物設計軟件和原核表達載體多克隆位點區(qū)的特點設計PCR擴增引物，引物兩端分別引入特異性酶切位點KpnI和XbaI，以hTERTcDNA為模板擴增外源基因序列，并經過回收純化得到外源基因片段。
　　 2.2重組質粒的構建
　　 真核表達載體pcDNA3.1-HisA和外源基因片段通過特異性內切酶KpnI和XbaI雙酶切，將

11、得到的酶切產物通過T4連接酶系統(tǒng)進行連接反應，所得連接產物轉化入大腸桿菌DH5α，構建轉化菌。提取真核重組質粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197，并進行一系列鑒定確定真核重組質粒的成功構建。
　　 2.3細胞轉染與蛋白表達
　　 采用脂質體轉染法將真核重組質粒轉染入人子宮癌Hela細胞和人胚腎293T細胞，轉染后48小時提取各自細胞的細胞核蛋白。通過免疫印跡法鑒定目的蛋白的表達情況。
　　 3.hTE

12、RTC197對Hela和293T細胞的細胞增殖及細胞活力的影響
　　 3.1細胞培養(yǎng)與轉染
　　 按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法對Hela細胞和293T細胞進行復蘇、傳代等操作。
　　 選擇96孔培養(yǎng)板接種細胞，將Hela細胞和293T細胞分別按1×104個/孔和1.1×104個/孔的細胞量各轉接于培養(yǎng)板。Hela細胞和293T細胞各轉接7塊96孔板，每塊培養(yǎng)板中鋪45個孔，待細胞貼壁后進行實驗干預。
　　 3.2細

13、胞增殖及細胞活性影響的統(tǒng)計學比較。
　　 實驗干預后每隔24h取出Hela細胞和293T細胞各一塊培養(yǎng)板，MTT法測量所有實驗孔OD值，空白組、空載體組和重組質粒組各有3×5=15個單獨樣本。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，使用析因分析法和單因素方差分析法進行統(tǒng)計分析，分析是否具有顯著性差異。
　　 依照公式:抑制率(％)=（1-重組質粒組OD值/空載體組OD值）×100％，計算每天的抑制率，從而得出hTERTC197對H

14、ela和293T細胞的細胞增殖及細胞活力的影響。
　　 結果:
　　 1.外源基因片段可以通過PCR的方法擴增。
　　 2.hTERTC197可以與原核載體pEGX-4T-1構建原核重組質粒。
　　 3.原核重組質粒pEGX-4T-1-hTERTC197可以在宿主菌BL21中通過IPTG誘導融合蛋白表達，并通過免疫印跡法證明其表達。
　　 4.hTERTC197可以與真核載體pcDNA3.1-Hi

15、sA構建真核重組質粒。
　　 5.真核重組質粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197可以通過脂質體轉染Hela細胞和293T細胞，并通過免疫印跡法證明，該蛋白能在細胞核內被檢測。
　　 6.依照單因素方差分析結果顯示，在實驗干預后七天內，每天的空白組與空載體均無顯著性差異(P＞0.05);每天的空白組與重組質粒組均有顯著性差異(P＜0.001);每天的空載體組與重組質粒組均有顯著性差異(P＜0.001)。即轉染載

16、體pcDNA3.1-HisA對Hela細胞和293T細胞的增殖和活力無影響，而轉染重組質粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197對Hela細胞和293T細胞的增殖和活力有影響。
　　 7.通過統(tǒng)計學分析證明hTERTC197可以抑制Hela細胞和293T細胞的細胞增殖及細胞力性。hTERTC197對Hela細胞最大抑制出現在第五天，抑制率為33.07±0.229(％);hTERTC197對293T細胞最大抑制出現在第五天

17、，抑制率為33.92±0.114(％)。
　　 結論:
　　 1.成功構建原核重組質粒pEGX-4T-1-hTERTC197，并成功在原核表達系統(tǒng)中表達融合蛋白。
　　 2.成功構建真核重組質粒pcDNA3.1-HisA-hTERTC197，并成功在真核表達系統(tǒng)中表達融合蛋白。
　　 3.hTERTC197對Hela細胞和293T細胞的細胞增殖及細胞活力具有顯著性的抑制作用。
　　 本實驗的創(chuàng)新之