應(yīng)用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因使兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞永生化的初步研究.pdf

1、目的:將外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)導(dǎo)入到新西蘭大白兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,探討該基因能否激活兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的端粒酶活性,并延長細(xì)胞在體外培養(yǎng)的壽命,并為以后的永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞系的建立奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1.用脂質(zhì)體方法將質(zhì)粒pLEGFP-C1-hTERT分別穩(wěn)轉(zhuǎn)和瞬轉(zhuǎn)PT67包裝細(xì)胞,收集病毒上清液,并用NIH3T3細(xì)胞測定病毒上清液的病毒滴度；2.第二代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分別被上述兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染后,經(jīng)G4

2、18藥物壓力篩選獲得克隆細(xì)胞并擴(kuò)增,從而初步建立永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；3.用RT-PCR方法檢測永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的hTERT-mRNA表達(dá),并與第二代的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相比較。
　　 結(jié)果:1.質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞后經(jīng)G418篩選后獲得了穩(wěn)定產(chǎn)毒的抗性細(xì)胞株,通過RT-PCR檢測抗性克隆株(PT67-hTERT)中的hTERT-mRNA表達(dá),并和正常PT67細(xì)胞相對照。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗性克隆株P(guān)T67和正常PT67細(xì)胞中均可見一

3、條擴(kuò)增帶,但抗性克隆株P(guān)T67的條帶明顯強(qiáng)于正常組PT67(p＜0.05)。說明hTERT-mRNA在正常的PT67細(xì)胞株中就有轉(zhuǎn)錄,但其外源性的hTERT基因使其轉(zhuǎn)錄明顯增強(qiáng)。并測得穩(wěn)轉(zhuǎn)后病毒的滴度為2.0×105CFU/ml;瞬轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液的病毒滴度為1.0×106CFU/ml。2.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,穩(wěn)轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液感染兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的感染率是28.55±6.99％,瞬轉(zhuǎn)包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒上清液感染兔

4、第二代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的感染率是81.42±11.45%。未感染的兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞做為空白對照,其感染率為0.23±0.05%。通過方差分析p＜0.05,認(rèn)為兩種病毒感染方法有顯著性差異。3.RT-PCR檢測永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的hTERT-mRNA表達(dá)時(shí),可見145bp的特異性電泳帶,而未感染的第二代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞卻未見條帶,說明hTERT基因被成功導(dǎo)入到第二代兔關(guān)節(jié)軟細(xì)胞中并被表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建