轉人端粒酶基因骨髓間充質干細胞的構建及其細胞特征分析.pdf

1、端粒酶是一種由RNA和蛋白質兩種組份構成的核糖核蛋白復合體,其中RNA組份是端粒酶復制時用的模板,蛋白質組分主要是端粒酶催化亞單位,又叫做端粒酶逆轉錄酶(hTERT),它的功能是利用RNA模板復制端粒的重復片段,延長端粒。端粒的長度和細胞分裂時端粒損失的速度決定了不表達端粒酶細胞的衰老和壽命,而在表達端粒酶的細胞中端粒酶能補充端粒長度,使細胞的生命延長甚至永生。骨髓間充質干細胞(hMSCs)在細胞移植,基因治療,組織工程方面有重要作用,

2、但是骨髓間充質干細胞體外增殖能力弱,傳代能力差。延長骨髓間充質干細胞的生命周期能彌補骨髓間充質干細胞來源的不足,具有重要的實際意義。因此,本研究制備了表達hTERT基因的重組逆轉錄病毒,在分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞的基礎上,將hTERT基因導入骨髓間充質干細胞中,并傳代290代以上。在傳代過程中,對轉導hTERT基因的細胞進行了功能和特性的分析。 目的：通過重組逆轉錄病毒技術體外轉導hTERT基因,建立過表達端粒酶的hMSCs,

3、經傳代培養(yǎng)觀察過表達端粒酶的hMSCs分裂和增殖能力以及細胞生命周期變化。闡明使用hTERT作為目的基因能否延長hMSCs的生命周期,并研究過表達端粒酶hMSCs的表面抗原,細胞核型特征與致瘤性,向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞方向分化的潛力以及細胞蛋白組學特征。為將來構建適用于臨床的、有較長生命周期和有一定分化能力的骨髓間充質干細胞打下理論基礎。 方法和結果：使用重組病毒技術構建表達hTERT的重組逆轉錄病毒,用該病毒感染骨髓

4、間充質干細胞,并使用TRAP-PCR方法證實我們重建了細胞的端粒酶活性。我們將轉導了hTERT的細胞接種于免疫缺陷小鼠皮下,未見腫瘤形成。轉導細胞的軟瓊脂細胞克隆形成實驗陰性,表明轉導hTERT的骨髓間充質干細胞未出現惡性轉化,沒有成瘤作用。另外,轉導了hTERT的骨髓間充質干細胞在相應誘導液的作用下,能夠向成骨細胞,軟骨細胞,脂肪細胞方向分化,證實了細胞的多向分化潛能。采用雙向凝膠電泳加基質輔助的激光解吸/離子化飛行時間質譜方法(2D

5、E-MALDI-TOF-MS)分析轉導hTERT與未轉導hTERT的hMSCs的蛋白組學差異,我們鑒定了100種蛋白點,發(fā)現有20種蛋白質有差異表達。結論：使用表達hTERT的重組逆轉錄病毒感染的骨髓間充質干細胞能夠再建細胞的端粒酶活性,克服細胞的復制衰老,延伸了細胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接種實驗和細胞克隆形成實驗表明轉導hTERT的骨髓間充質干細胞沒有成瘤作用。在相應誘導液的作用下,轉導hTERT的骨髓間充質干細胞能夠向成骨細胞,