轉(zhuǎn)人端粒酶基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及其細(xì)胞特征分析.pdf

1、端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)兩種組份構(gòu)成的核糖核蛋白復(fù)合體,其中RNA組份是端粒酶復(fù)制時用的模板,蛋白質(zhì)組分主要是端粒酶催化亞單位,又叫做端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT),它的功能是利用RNA模板復(fù)制端粒的重復(fù)片段,延長端粒。端粒的長度和細(xì)胞分裂時端粒損失的速度決定了不表達端粒酶細(xì)胞的衰老和壽命,而在表達端粒酶的細(xì)胞中端粒酶能補充端粒長度,使細(xì)胞的生命延長甚至永生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)在細(xì)胞移植,基因治療,組織工程方面有重要作用,

2、但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力弱,傳代能力差。延長骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生命周期能彌補骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的不足,具有重要的實際意義。因此,本研究制備了表達hTERT基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,在分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,將hTERT基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞中,并傳代290代以上。在傳代過程中,對轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因的細(xì)胞進行了功能和特性的分析。 目的：通過重組逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)體外轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因,建立過表達端粒酶的hMSCs,

3、經(jīng)傳代培養(yǎng)觀察過表達端粒酶的hMSCs分裂和增殖能力以及細(xì)胞生命周期變化。闡明使用hTERT作為目的基因能否延長hMSCs的生命周期,并研究過表達端粒酶hMSCs的表面抗原,細(xì)胞核型特征與致瘤性,向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向分化的潛力以及細(xì)胞蛋白組學(xué)特征。為將來構(gòu)建適用于臨床的、有較長生命周期和有一定分化能力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞打下理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果：使用重組病毒技術(shù)構(gòu)建表達hTERT的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,用該病毒感染骨髓

4、間充質(zhì)干細(xì)胞,并使用TRAP-PCR方法證實我們重建了細(xì)胞的端粒酶活性。我們將轉(zhuǎn)導(dǎo)了hTERT的細(xì)胞接種于免疫缺陷小鼠皮下,未見腫瘤形成。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實驗陰性,表明轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化,沒有成瘤作用。另外,轉(zhuǎn)導(dǎo)了hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在相應(yīng)誘導(dǎo)液的作用下,能夠向成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞方向分化,證實了細(xì)胞的多向分化潛能。采用雙向凝膠電泳加基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜方法(2D

5、E-MALDI-TOF-MS)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT與未轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的hMSCs的蛋白組學(xué)差異,我們鑒定了100種蛋白點,發(fā)現(xiàn)有20種蛋白質(zhì)有差異表達。結(jié)論：使用表達hTERT的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠再建細(xì)胞的端粒酶活性,克服細(xì)胞的復(fù)制衰老,延伸了細(xì)胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接種實驗和細(xì)胞克隆形成實驗表明轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沒有成瘤作用。在相應(yīng)誘導(dǎo)液的作用下,轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向成骨細(xì)胞,