人β-NGF基因載體的構(gòu)建及其在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、鄭碩士論文題目：作者姓名：學(xué)科門(mén)類(lèi)：專業(yè)名稱：導(dǎo)師姓名、職稱：學(xué)位授予單位代碼學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)柮芗?jí)堂一論文人B—NGF基因載體的構(gòu)建及其在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)范波勝醫(yī)學(xué)神經(jīng)生理學(xué)章茜教授邢瑩教授二oo五年五月二十B盞一鄭州丈學(xué)2005毀歡士研究，#畢業(yè)論文(摘要)人BNGF基因載體的構(gòu)建段其在兔骨鰱問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)真核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)其在兔BMSCs中表達(dá)。方法1從人血白細(xì)胞中提取人基因組DNA，設(shè)計(jì)合適引物，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出

2、人BNGF前體基因并與pMDl8載體連接，經(jīng)篩選得到重組質(zhì)粒pMDl8BNGF，雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定。2將質(zhì)粒pMDl8p—NGF用BamHI、＆oRV酶進(jìn)行雙酶切，獲得人13一NGF基因片段，將其插入相同酶切的真核表達(dá)載體pcDNA30，構(gòu)建基因重組真核表達(dá)載體pcDNA30p—NGF，雙酶切對(duì)重組載體鑒定。3采集和培養(yǎng)兔BMSCs：應(yīng)用密度梯度離心法分離兔骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclealcells，MNCs)，以1106c

3、ells／ml細(xì)胞接種于50ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將己構(gòu)建的pcDNA30BNGF質(zhì)粒導(dǎo)入體外培養(yǎng)的兔BMSCs中，加入G418進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性細(xì)胞克隆，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。5分別應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)人0NGFfiIJ體基因的mRNA和ELISA方法對(duì)人BNGF蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1經(jīng)酶切電泳和DNA測(cè)序證實(shí)，PCR擴(kuò)出的片段確為人6NGF蒔體基因序列(約726bp)。2

4、成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3013一NGF質(zhì)粒。3采集和培養(yǎng)的兔BMSCs生長(zhǎng)良好并穩(wěn)定傳代。4轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選得到抗性細(xì)胞克隆并進(jìn)行培養(yǎng)。5在轉(zhuǎn)染入pcDNA30—0一NGF質(zhì)粒的兔BMSCs中，應(yīng)用RTPCR可檢測(cè)到人B。NGF前體基凼的mRNA，在其培養(yǎng)上清中應(yīng)用ELISA方法可檢測(cè)到人NGF蛋白。結(jié)論1成功克隆人日NGFfiF體基岡全長(zhǎng)序列并成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA30一B—NGF質(zhì)粒。2人B—NGF基因在