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文檔簡介
1、目的：分離培養(yǎng)人原代骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hMSC)并通過多能性和表型進行鑒定，應用分子生物學方法證明hMSC有無功能性表達OCT4。
方法：利用Ficoll液分離出骨髓單個核細胞，貼壁培養(yǎng)72h后換液，去除未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合達80％時應用于實驗。取第3代hMSC進行成脂、成骨分化誘導，然后相應的給予油紅O染色和堿性磷酸酶染色，同時
2、用流式(flow cytometry, FCM)分析細胞表型，以對hMSC進行鑒定。提取hMSC第1、3、5代細胞總RNA和總蛋白，以人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)H9為陽性對照，分別經(jīng)逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白質印跡(western blot, WB)檢測細胞OCT4的表
3、達情況。
結果：成功分離培養(yǎng)出原代hMSC;成脂、成骨誘導分化及相應的組織化學染色細胞內分別可見脂肪滴和藍色顆粒狀物質；流式分析細胞表面標記物：均一表達CD44、CD73，陽性率均達95％以上，而不表達造血細胞和內皮細胞標志CD14、CD34、CD45、CD31： RT-PCR表明細胞在mRNA水平上表達OCT-4,但WB雜交證實細胞在蛋白水平上不表達OCT-4。
結論：成功分離擴增hMSC，擴增的細胞純度很
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