攜帶Akt1基因慢病毒載體構建及在人骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達.pdf

1、目的：構建攜帶蛋白激酶B(Protein Kinase B，Akt1)基因的慢病毒載體，感染人骨髓間充質(zhì)干細胞(human Mesenchymal Stem Cells hMSCs)，將Akt1基因整合入hMSCs，為研究Akt1基因聯(lián)合MSCs進行細胞心肌成形術奠定基礎。 方法：通過測序鑒定pMSCV-Akt1質(zhì)粒，使用BglII和SalI雙酶切Akt1，收獲Akt1目的片段并亞克降至慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pXZ208的Xho I、B

2、amHI位點。重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為pXZ208-Akt1，轉(zhuǎn)化后挑選單克隆擴增進行雙酶切鑒定。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pXZ208-Akt1和包裝質(zhì)粒NRF、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG共同轉(zhuǎn)染293T細胞(pXZ171表達綠色熒光蛋白質(zhì)粒作為對照)，收獲病毒，測定滴度。進一步通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法在體外提取、擴增培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)，并經(jīng)免疫組化檢測MSCs的CD29、CD34的表達情況。攜帶Akt1基因的慢病毒以

3、MOI=2感染hMSCs后，流式細胞儀檢測病毒感染效率，用western blot方法檢測AKT1蛋白表達。 結(jié)果：通過雙酶切鑒定轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pXZ208-Akt1構建正確，包裝產(chǎn)生病毒滴度為AKT1組6.25×105TU/ml。經(jīng)過熒光顯微鏡以及流式細胞儀檢測感染率達80％以上，AKT1基因轉(zhuǎn)導hMSCs細胞組經(jīng)western blot證實有高水平AKT1表達。 結(jié)論：攜帶Akt1慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構建成功，成功包裝攜帶Akt