攜帶hBMp-2的tet-on慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及Hbmp-2的體外表達(dá).pdf

1、目的：研究攜帶hBMP-2的tet-on慢病毒載體對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后hBMP-2在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。
　　 方法：按照文獻(xiàn)方法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，消化傳代，轉(zhuǎn)染前一天，選取3-4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUCMSCs按照融合度40％接種到六孔板中，第二天進(jìn)行pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA、

2、pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP2共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后8h更換培養(yǎng)液。待培養(yǎng)24h之后用嘌呤霉素和G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選。提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定基因是否已成功轉(zhuǎn)入。選取穩(wěn)定篩選后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，分別在不同強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度相同誘導(dǎo)時(shí)間和不同誘導(dǎo)時(shí)間相同強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)濃度情況下用ELISA測(cè)定hBMP-2的表達(dá)情況。對(duì)轉(zhuǎn)染前后的HUMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，用茜素紅染色法觀察礦化物結(jié)節(jié)形成情況。
　　 結(jié)果：攜帶hBMP-

3、2的tet-on慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，且HUCMSCs可以通過(guò)強(qiáng)力霉素的誘導(dǎo)可控性表達(dá)hBMP-2。在相同誘導(dǎo)時(shí)間情況下，強(qiáng)力霉素10μ g/ml時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)，而在相同誘導(dǎo)濃度下，hBMP-2的表達(dá)在誘導(dǎo)48h后達(dá)峰值。HUCMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色示細(xì)胞漿中有大量紅色的鈣化基質(zhì)沉積。
　　 結(jié)論：攜帶hBMP-2的tet-on慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并初步研究了hBMP-2在體外