重組hBMP-2腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定及其體外表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的] 采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因重組腺病毒載體，力圖縮短重組腺病毒BMP-2的構(gòu)建周期，提高構(gòu)建成功效率，為進(jìn)一步對骨缺損、骨創(chuàng)傷等疾病采用骨基因治療以提高成骨速率及成骨質(zhì)量奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [方法] 依據(jù)Genbank中hBMP-2序列化學(xué)合成含BamhⅠ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的兩條引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增BMP-2目的基因，并插入克隆載體pMD19-T simple vector中

2、，接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒獲得了TS-BMP-2，酶切鑒定并進(jìn)行測序分析?；驕y序正確后，重組質(zhì)粒TS-BMP-2與穿梭載體pEC3.1（+）分別各用BamHⅠ和EcoRⅠ兩步法雙酶切后連接，從而將TS-BMP2基因亞克隆到穿梭載體pEC3.1（+）中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)菌，質(zhì)粒小量純化試劑盒抽提，獲得pEC3.1-BMP-2穿梭質(zhì)粒。pEC3.1-BMP-2用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶

3、切后，應(yīng)用LR ClonaseⅡ重組酶，與pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒載體進(jìn)行體外同源重組反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)菌，抽提質(zhì)粒，獲得pAd-BMP-2重組質(zhì)粒，同時(shí)用XbaⅠ酶切鑒定及PCR鑒定重組質(zhì)粒的正確性。重組質(zhì)粒pAd-BMP-2經(jīng)PacⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得重組腺病毒rAd-BMP-2顆粒，經(jīng)PCR方法鑒定所得rAd-BMP-2為正確目的腺病毒載體。將所得病毒

4、原液反復(fù)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后進(jìn)行病毒擴(kuò)增，經(jīng)3-4代大量病毒擴(kuò)增后收集并純化，獲得了實(shí)驗(yàn)所需要的病毒滴度，最后用空斑實(shí)驗(yàn)方法測定病毒滴度。Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs測定腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率，確定最佳感染復(fù)數(shù)。Ad-BMP-2體外轉(zhuǎn)染MSCs，Western blot檢測BMP-2在蛋白水平的表達(dá)。 [結(jié)果] 成功構(gòu)建Ad-BMP-2腺病毒載體，測得病毒滴度為1×1010 pfu/ml。Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs，當(dāng)MOI為1

5、00時(shí)，超過95％的細(xì)胞出現(xiàn)熒光，選擇MOI=100為最佳感染復(fù)數(shù)。病毒感染四周后鏡下仍可見細(xì)胞出現(xiàn)熒光，表明獲得的重組腺病毒活性較高，可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因并維持一定時(shí)間表達(dá)。Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染MSCs后，初始有部分細(xì)胞呈皺縮表現(xiàn)，甚至死亡，24h后開始恢復(fù)原有形態(tài)。Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h即有BMP-2基因表達(dá)，在2周和3周時(shí)表達(dá)較強(qiáng)，4周后表達(dá)開始減弱，5周后表達(dá)明顯減弱。實(shí)驗(yàn)表明構(gòu)建的腺病毒載體可有效轉(zhuǎn)染MSC