hBMP-2和hFGF-2雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、[目的]
　　 構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2)和人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(human fibroblast growth factor-2，hFGF-2)雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體，并對(duì)其鑒定，為后續(xù)基因治療和細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 通過(guò)引入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(internal ribosome entry

2、site，IRES)，采用基于λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的Gateway^TM技術(shù)構(gòu)建帶有hBMP-2和hFGF-2雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction，PCR)方法擴(kuò)增hBMP-2和hFGF-2目的基因，將兩個(gè)基因亞克隆至pIRES2-EGFP中，構(gòu)建phBMP2-IRES-hFGF2，菌落PCR、雙酶切電泳及測(cè)序鑒定。通過(guò)BP反應(yīng)將hBMP2-IRES-hFGF2重組到載體p

3、DONR221中，再通過(guò)LR反應(yīng)將其轉(zhuǎn)移到腺病毒載體pAD/CMV/V5-DEST中。測(cè)序鑒定重組成功后將其線性化，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染線性化的重組腺病毒載體于293細(xì)胞以包裝制備重組腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2。重組腺病毒經(jīng)PCR鑒定之后反復(fù)感染293細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增并純化。通過(guò)免疫法測(cè)定腺病毒滴度。
　　 [結(jié)果]
　　 成功擴(kuò)增出hBMP-2和hFGF-2基因片段，phBMP2-IRES-hFGF2經(jīng)菌落PCR

4、、雙酶切及測(cè)序鑒定正確。提取重組腺病毒基因組成功擴(kuò)增出外源目的基因hBMP-2和hFGF-2片段，重組腺病毒在293細(xì)胞中包裝成功，獲得成熟的病毒顆粒，測(cè)得病毒滴度為2.82×1010ifu/ml。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建攜帶hBMP-2和hFGF-2雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體，收獲的病毒具有較高滴度，為以后利用腺病毒載體進(jìn)行hBMP-2及hFGF-2雙基因共表達(dá)干預(yù)骨修復(fù)的體外及體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。