PPARγ-,2-基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶PPARγ<,2>基因的腺病毒載體，為進一步研究PPARγ<,2>基因的功能，為闡明HBV感染導(dǎo)致肝癌的機制研究建立基礎(chǔ)。 方法：本課題采用PCR技術(shù)從pcDNA3質(zhì)粒中擴增小鼠PPARγ<,2>基因，將PPARγ<,2>基因亞克隆至質(zhì)粒穿梭載體pAdTrack-CMV中，同時與pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染293細胞，確定轉(zhuǎn)染率，并轉(zhuǎn)化到肝臟L02細胞表達。 第一部分：以小鼠PPARγ<,2>基因質(zhì)粒(PPAR

2、γ<,2>-pcDNA3)為材料，通過PCR方法擴增小鼠PPARγ<,2>基因，獲得目的基因PPARγ<,2>，分別用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切PPARγ<,2>基因片段和pAdTrack-CMV，用T4DNA Ligase(連接酶)連接，將PPARγ<,2>基因片段亞克隆到pAdTrack-PPARγ<,2>-CMV中，構(gòu)建腺病毒(adenovirus)穿梭質(zhì)粒載體。正確重組的pAd-track-PPARγ<,2>，用PmeⅠ線性化后

3、與pAd Easy-1在BJ5183中同源重組，酶切得到一條23 kb左右的大片段和一條約4.5kb的特征性小片段，表明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。 結(jié)果：經(jīng)PCR擴增的PPARγ<,2>片段克隆到腺病毒載體中，獲得目的基因的測序結(jié)果與GENEBANK報道的序列一致(pubmed RID：1144300157-17643-133739705 380BLASTQ1)。正確重組的pAd-track-PPARγ<,2>用PmeI線性化后與

4、pAd Easy-1在B55183中同源重組，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，以pAd Easy-1為對照，重組腺病毒質(zhì)粒酶切可見一條23 kb左右的大片段和一條約4.5kb的特征性小片段，表明重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。 第二部分：重組腺病毒的包裝、鑒定及表達，用脂質(zhì)體(lipid body)轉(zhuǎn)染法(infection protocol)，將重組腺病毒pAdTrack-PPARγ<,2>-CMV和pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染HEK

5、293細胞，包裝成pAdEasy-PPARγ<,2>腺病毒，確定轉(zhuǎn)染效率。檢測培養(yǎng)上清液病毒中PPARγ<,2>的存在后，將重組腺病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到L02細胞中，經(jīng)RT-PCR檢測和Western blotting蛋白質(zhì)表達，感染的重組PPARγ<,2>基因在L02細胞中能較高的穩(wěn)定表達。 結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果顯示，腺病毒Ad-PPARγ<,2>PCR產(chǎn)物約為470bp；用抗PPARγ<,2>單克隆抗體做western blo