大鼠Foxo3a基因的克隆及其重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　 卵巢功能早衰(Premature ovarian Failure,POF)是多種病因所致的卵巢功能衰竭,發(fā)生于青春發(fā)育后至40歲以前的婦女,以閉經(jīng)為主要臨床表現(xiàn),并伴有血清雌二醇水平下降和促性腺激素水平上升。卵巢早衰在臨床上可出現(xiàn)岡雌激素低落而發(fā)生的潮熱、出汗、情緒不穩(wěn)定、疲乏、記憶力下降等神經(jīng)精神癥狀以及閉經(jīng)、外陰干燥、疼痛、尿頻、尿急等生殖泌尿道萎縮刺激癥狀和其他相應的臨床癥狀。因缺少雌激素的保護,有患者可

2、能會出現(xiàn)心腦血管疾病和骨質(zhì)疏松等伴發(fā)疾病。且大多數(shù)POF患者要受到不孕癥的困擾。特別是對有生育要求的POF患者,這將給她們帶來精神和身體上的極大痛苦。實驗室檢查可以發(fā)現(xiàn)POF患者血中FSH和LH持續(xù)在40IU/L以上,FSH升高更明顯,雌二醇(E2)常低于50～70pmol/L。經(jīng)陰道超聲檢查可見POF患者子宮、卵巢小于生育期婦女,卵巢內(nèi)無卵泡存在或雖有卵泡存在、但數(shù)目很少,卵泡直徑很少在10mm以上,連續(xù)監(jiān)測無卵泡發(fā)育及成熟。

3、　　 POF的病因復雜,目前認為POF的發(fā)病與自身免疫功能異常、染色體異常、遺傳因素、代謝異常、醫(yī)源性及感染性因素等有關(guān)。近年來,惡性腫瘤的發(fā)病率呈持續(xù)升高,因化療而導致卵巢功能低下和不孕的患者日漸增多,成為POF發(fā)病的一個重要因為,化療藥物具有明確的卵巢毒性,主要通過誘導卵母細胞和顆粒細胞發(fā)生凋亡,使卵泡閉鎖,發(fā)生POF。現(xiàn)階段POF的治療常儀以雌孕激素替代治療和輔助生育技術(shù)為主,可以暫時緩解患者的更年期癥狀,但這些治療方法并不能從

4、根本上治療POF,且常年應用還可能帶來嚴重的副作用。隨著惡性腫瘤患者年輕化及化療后患者存活率的提高,尋找新的治療途徑已成為婦產(chǎn)科醫(yī)務人員的迫切任務。
　　 Foxo3a是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族“O”組成員之一,近年研究發(fā)現(xiàn),Foxo3a基因是一個調(diào)節(jié)及抑制卵巢中卵泡活化的關(guān)鍵基因。其主要通過P13K途徑起作用,Akt被激活后,Foxo3a出核而失去轉(zhuǎn)錄活性。Foxo3a功能完全缺乏會導致大量始基卵泡的活化,隨之開始出現(xiàn)性成熟,進一步會

5、使卵泡過早的耗竭,導致卵巢早衰和不孕癥的發(fā)生。Foxo3a也能增強周期抑蛋白的表達使細胞周期停止于G0/G1期。女性的生育期限由出生時原始卵泡池的大小和儲備量以及出生后卵泡閉鎖的速率所決定。卵巢早衰的婦女,無論是遺傳因素還是醫(yī)源性因素,根本因為為始基卵泡的過度耗竭,因此,如果能上調(diào)Foxo3a基因,不僅能抑制卵泡活化,保存生育功能,還能使細胞停在相對靜止的細胞間期,降低化療藥對其的損害作用。
　　 近年來,分子生物學領(lǐng)域取得了迅

6、猛發(fā)展,基因治療作為一種新的醫(yī)療手段,為人類疾病治療開辟了一條新的途徑。如何安全地轉(zhuǎn)移治療基因,使其在宿主細胞中高效表達是基因治療的關(guān)鍵。在眾多的病毒載體中,腺病毒倍受關(guān)注,因有以下五大優(yōu)點,使其在臨床上得到廣泛應用。①既可以感染分裂期細胞,又可以感染非分裂期細胞；②外源基因表達水平高；③病毒滴度高,制備純化相對容易；④插入外源基因容量大；⑤病毒基因組較少發(fā)生重排。其中應用最多的是人5型腺病毒(Ad5)。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesench

7、ymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓微環(huán)境中的一種成體干細胞,具有不可忽視的優(yōu)點,具有多向分化潛能,取材方便,能在體外大量擴增,可行自體移植,避免了免疫排斥反應及倫理道德等問題,因而具有廣闊的應用前景。本課題擬通過分子生物學相關(guān)技術(shù),利用改進的攜帶綠色熒光蛋白的AdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建攜帶大鼠Fox03a基因的重組腺病毒,包裝、擴增、純化后,體外感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,為進一步探討利用Foxo3a進行卵巢

8、早衰的基因治療提供了相關(guān)實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 為深入研究Foxo3a基因治療化療性卵巢早衰的可行性與有效性,我們擬應用AdEasy-1腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建包含大鼠Foxo3a基因的缺陷型腺病毒質(zhì)粒,利用相應的包裝細胞系,制備具有感染能力的腺病毒顆粒,并感染有多分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細胞,為進一步研究Foxo3a基因在化療性卵巢早衰動物模型上的治療作用打下基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.提取大鼠脾臟總RN

9、A,運用重疊延伸聚合酶鏈反應(Overlap-PCR)方法,設計特定限制性酶切位點,合成大鼠。Foxo3a基因編碼區(qū)全長序列,亞克隆至pMD19-T載體中,用堿裂解法提取質(zhì)粒,對含目的片段的陽性重組克隆進行全序列測定。測序結(jié)果均通過互聯(lián)網(wǎng)用Advanced BLAST2.0軟件與GenebBank中的大鼠Foxo3a-cDNA序列進行同源性分析。
　　 2.將測序正確的陽性重組質(zhì)粒大量擴增并純化,經(jīng)Xbal及KpnI兩種特異性酶

10、切后定向克隆到攜帶綠色熒光蛋白(green fluorecence protein,GFP)的AdEasy-1系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-fox。Pme Ⅰ酶切pAdTrack-fox后轉(zhuǎn)化至含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細菌中進行同源重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒。
　　 3.將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后,通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細胞,得到

11、包含大鼠Foxo3a基因的完整腺病毒顆粒Ad-fox,通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后,用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50法)測定其病毒滴度。提取病毒液的總RNA,運用RT-PCR方法檢測病毒中Foxo3a基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。
　　 4.將攜帶Foxo3a基因的腺病毒感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,RT-PCR法檢測Foxo3a的mRNA表達情況,臺盼蘭檢測感染后細胞活力,運用MTT方法檢測Ad-fox感染后的MSCs細胞增殖情

12、況,并繪制生長曲線。
　　 結(jié)果
　　 1.從大鼠脾臟組織中提取的總RNA,瓊脂糖凝膠電泳,可見3條清晰的RNA帶(28S、18S與5S),反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA,經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳,可見約2019bpDNA條帶,與預期的結(jié)果相符。重組陽性克隆酶切后電泳得到2019bp和2700bp條帶,提取質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果進行同源性分析,同源性為99.9％。證實成功得到編碼大鼠Foxo3a蛋白的基因片段。
　　

13、2.將大鼠Foxo3a基因插入重組病毒載體中。經(jīng)特異性酶切反應鑒定,證實重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-fox構(gòu)建成功。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證,所獲得目的基因序列與已發(fā)表的大鼠Foxo3a基因序列相比,有兩個堿基發(fā)生突變,但其編碼的蛋白序列與GenBank中大鼠Foxo3a.蛋白質(zhì)序列完全一致,屬于沉默突變型,不影響后續(xù)表達。
　　 3.重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-fox大量擴增純化后,在體外利用脂質(zhì)體2000成功轉(zhuǎn)染病毒包裝

14、細胞HEK293,最早在轉(zhuǎn)染后24小時,在熒光顯微鏡下可見GFP的表達；約在轉(zhuǎn)染后14天,大部分HEK293細胞胞體固縮、懸浮,收集細胞裂解液進行PCR鑒定,得到預期2019bp大小的Foxo3a基因條帶,證實重組腺病毒Ad-fox已包裝成功。利用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測得,擴增純化后獲得的重組腺病毒Ad-fox滴度(Titer)為1.2×10-10pfu/ml。
　　 4.采用不同MOI的病毒液感染大鼠骨髓間充

15、質(zhì)干細胞,感染后培養(yǎng)48h在熒光顯微鏡下觀察其感染效率,結(jié)果可見:當MOI為10時,僅有10％左右的細胞有熒光表達:當MOI為100時,約有90％以上的細胞GFP表達陽性,且細胞形態(tài)與未感染細胞相同。用RT-PCR法檢測到被感染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞Fox03amRNA的表達,MTT法測得最佳MOI感染細胞與對照組細胞的生長曲線無明顯差異。
　　 結(jié)論
　　 1.本實驗成功克隆了大鼠Foxo3a基因,為進一步研究Foxo

16、3a cDNA的基因功能及進行基因治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.成功構(gòu)建了攜帶人鼠Foxo3a基因融合綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒載體,并包裝出高滴度、高純度的腺病毒。
　　 3.攜帶Foxo3a基因的重組腺病毒載體感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞后,Foxo3a基因有效進行了轉(zhuǎn)錄,在MOI值為100時感染效率達90％,細胞具有最佳的生長狀態(tài),且細胞活力及細胞增殖曲線無明顯改變。本研究為進一步探討利用Foxo3a進行卵巢早衰的基因