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文檔簡介
1、目的:利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建并鑒定小鼠降鈣素基因相關(guān)肽基因(calcitonin gene-related peptide,CGRP)重組腺病毒載體。方法:采用RT-PCR方法擴(kuò)增出含有小鼠CGRP全長cDNA的基因片段并與PUC57重組,經(jīng)測序驗證無誤后,將小鼠CGRP基因亞克隆至穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV上。在大腸桿菌BJ5183中與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進(jìn)行同源重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒,經(jīng)過抗性篩選以及
2、酶切鑒定得到陽性的重組質(zhì)粒在XL-Gold細(xì)胞中擴(kuò)增。然后在人胚腎293細(xì)胞中進(jìn)行重組腺病毒的包裝擴(kuò)增,并經(jīng)氯化銫純化得到重組腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP。結(jié)果:測序證實PUG57-CGRP重組質(zhì)粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重組穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV-CGRP經(jīng)雙酶切鑒定后可見約7.5kb和423bp片段;重組腺病毒質(zhì)粒AdEasy-pShuttle-CGRP經(jīng)PacⅠ酶切可見長約3.0kb與30.0
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