人Dazl基因重組腺病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、背景與目的
　　生殖健康是當(dāng)今世界愈來愈受到關(guān)注的問題。治療因生殖細(xì)胞缺陷所致的男性不育是醫(yī)學(xué)的一大難題,干細(xì)胞的多能性及體外受精技術(shù)為解決該難題提供了技術(shù)方法。我們前期的研究證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Humanumbilicalcordwharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcells,HUMSCs)經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)能向男性生殖細(xì)胞方向分化,但在分化至減數(shù)分裂前期的生殖細(xì)胞時存在“分化停滯”,因此尋找

2、其它途徑讓HUMSCs分化為成熟的精子并能用于男性不育的治療是當(dāng)前急需解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。DeletedinAzoospermia-Like(DAZL)基因是表達(dá)生殖細(xì)胞特異RNA結(jié)合蛋白的基因,是精子發(fā)生的重要調(diào)控因子,該基因突變或表達(dá)缺乏將導(dǎo)致精子發(fā)生過程減數(shù)分裂障礙和雄性不育。腺病毒(adenovirus,Ad)載體是一類已得到大量研究并有臨床應(yīng)用報道的載體系統(tǒng)。它具有病毒滴度高、宿主細(xì)胞范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高和不會整合人靶細(xì)胞基因組

3、等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)此,本研究擬采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)的DAZL重組腺病毒載體系統(tǒng),結(jié)合前期對HUMSCs的研究,通過DAZL基因異位表達(dá)誘導(dǎo)HUMSCs體外分化為男性生殖細(xì)胞提供轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及實(shí)驗(yàn)支持。
　　材料與方法
　　1、依據(jù)Genbank中DAZL序列化學(xué)合成全基因序列,應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增DAZL目的基因,并插入克隆載體pMD18-Tsimplevector中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒獲得了T

4、S-DAZL,酶切鑒定并進(jìn)行測序分析。
　　2、基因測序正確后,重組質(zhì)粒TS-DAZL與穿梭載體pIRES2-EGFP,各用XhoI及EcoRI酶兩步法雙酶切后連接,將TS-DAZL基因亞克隆到穿梭載體pIRES2-EGFP中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒獲得了pIRES2-EGFP-DAZL,酶切鑒定并進(jìn)行測序分析。
　　3、應(yīng)用BPClonaseII重組酶,與pDONR221進(jìn)行同源重組反應(yīng),獲得

5、入門克隆;應(yīng)用LRClonaseII重組酶,與pAD/CMV-DEST腺病毒載體進(jìn)行LR體外同源重組反應(yīng),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)菌,抽提質(zhì)粒,獲得pAd-DAZL-EGFP重組質(zhì)粒。
　　4、重組質(zhì)粒pAd-DAZL-EGFP經(jīng)PacI酶切線性化后轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝,獲得重組腺病毒顆粒Ad-EGFP-DAZL。將所得病毒原液反復(fù)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后進(jìn)行病毒擴(kuò)增,經(jīng)3-4代大量病毒擴(kuò)增后收集并純化,最后用免

6、疫法測定病毒滴度。
　　5、Ad-EGFP-DAZL轉(zhuǎn)染HUMSCs測定腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率,確定最佳感染復(fù)數(shù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　全基因合成目的基因,各中間載體經(jīng)PCR法,限制性酶切分析,DNA測序證實(shí)正確。轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞7-10天出現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡及脫落等細(xì)胞病變表現(xiàn),10-13天細(xì)胞病變達(dá)80％,最終的包裝病毒中攜帶有目的基因,并能夠在包裝細(xì)胞中的表達(dá)。免疫法測定病毒滴度測得病毒滴度約為1.04*10

7、9puf/ml。Ad-DAZL-GFP轉(zhuǎn)染HUMSCs,當(dāng)MOI為100時,超過80%的細(xì)胞出現(xiàn)熒光,且不影響靶細(xì)胞生長,選擇MOI=100為最佳感染復(fù)數(shù)。
　　結(jié)論
　　采用GatewayTM技術(shù)能有效且較為方便的構(gòu)建人DAZL基因重組腺病毒載體,重組子能夠在293A細(xì)胞中擴(kuò)增,病毒包裝的成功為進(jìn)一步研究DAZL體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提供了一個良好的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。在腺病毒載體介導(dǎo)下DAZL基因可高效感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,最