人LMP-1基因的腺病毒重組體構(gòu)建及在BMSCs的表達(dá).pdf

1、目的：應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建人LMP-1基因的腺病毒重組體，感染體外培養(yǎng)的兔BMSCs，鑒定細(xì)胞對(duì)LMP-1的表達(dá)情況，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：采用PCR的方法以pIRES2-EGFP-LMP-1質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增，在下游引物中加入特定序列，使擴(kuò)增出的LMP-1基因帶有編碼6個(gè)組氨酸(即His標(biāo)簽)的堿基序列。將得到的帶有His標(biāo)簽堿基序列的LMP-1基因作為目的基因，通過(guò)TA克隆與pMD18-T載體連接

2、并測(cè)序。雙酶切后插入至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdirack-CMV內(nèi)。Pme Ⅰ線性化陽(yáng)性克隆pAdtrack-LMP-1，在BJ5183菌內(nèi)完成與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的同源重組，構(gòu)建出重組腺病毒質(zhì)粒pAd-LMP-1。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)在HEK293細(xì)胞內(nèi)包裝出復(fù)制缺陷的重組腺病毒Ad-LMP-1，大量擴(kuò)增、純化并測(cè)定滴度。 結(jié)合骨髓密度梯度離心法和貼壁篩選法從兔骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs。重組腺病毒以不同的MOI感染第三代BMSC

3、s，在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)情況及感染效率。然后以最佳MOI感染BMSCs，3天后收集細(xì)胞行RT-PCR法檢測(cè)LMP-1基因的mRNA表達(dá)，再利用抗His標(biāo)簽的特異抗體以Western Blot的方法鑒定LMP-1基因的蛋白表達(dá)。 結(jié)果：測(cè)序鑒定攜帶His標(biāo)簽的LMP-1基因的重組質(zhì)粒pMD18-T構(gòu)建成功。成熟的體外分離培養(yǎng)BMSCs的方法方便簡(jiǎn)單，收獲細(xì)胞數(shù)量多且增殖能力強(qiáng)。重組腺病毒以150的MOI值感染兔BMSCs可以獲得最