含LacZ基因重組腺病毒的制備及其在大鼠脊髓中的表達(dá).pdf

1、目的:神經(jīng)損傷后的修復(fù)仍然是困擾著神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)與臨床的一道難關(guān)。但由于其自身結(jié)構(gòu)及再生特點(diǎn),僅依靠外科手術(shù)修復(fù)斷裂神經(jīng),其遠(yuǎn)期結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù),尤其是運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)難以獲得滿意的效果。在治療外周神經(jīng)損傷的各種方法中,基因治療的研究進(jìn)展尤為受到重視。周圍神經(jīng)損傷基因治療是指通過(guò)某種方法、途徑將目的基因?qū)肴梭w細(xì)胞,使其在體內(nèi)發(fā)揮作用,以達(dá)到基因治療的目的,這不僅包括對(duì)中樞神經(jīng)元的保護(hù)作用,還要能促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)。其中腺病毒載體在神經(jīng)再生、

2、神經(jīng)肌肉疾病以及神經(jīng)示蹤等基因治療的實(shí)驗(yàn)研究方面已經(jīng)表現(xiàn)出了多方面的優(yōu)勢(shì)。腺病毒載體是目前使用最多的病毒載體之一,其常用于表達(dá)外源性蛋白,是很好的表達(dá)重組抗原的載體系統(tǒng)。其具有宿主范圍廣泛、基因轉(zhuǎn)移效率高、重組病毒滴度相對(duì)較高、外源基因容量較大、所介導(dǎo)的外源性基因的表達(dá)水平高以及不會(huì)引起宿主細(xì)胞基因突變等優(yōu)點(diǎn),并且其表達(dá)的外源蛋白具有天然蛋白的特性。這些特點(diǎn)使腺病毒成為基因治療的重要載體。重組腺病毒載體(Recombinant aden

3、ovirus,AdV)既能感染分裂期細(xì)胞,也能感染非分裂期細(xì)胞,且攜帶的外源基因可長(zhǎng)期存在,穩(wěn)定表達(dá),因此被普遍用于將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞,被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)高效的基因轉(zhuǎn)染載體。正因?yàn)槠滢D(zhuǎn)染細(xì)胞的高效性、多樣性及轉(zhuǎn)染后的安全性等特點(diǎn),AdV的應(yīng)用為基因治療外周神經(jīng)損傷帶來(lái)了希望。我們擬構(gòu)建含LacZ基因的重組質(zhì)粒,制備攜帶目的基因LacZ的病毒,并期望能進(jìn)一步將此載體通過(guò)損傷的外周神經(jīng)傳至脊髓,觀察其在靶神經(jīng)元的表達(dá)及其產(chǎn)物對(duì)外周神經(jīng)的標(biāo)

4、記進(jìn)程,掌握轉(zhuǎn)基因的表達(dá)規(guī)律和特點(diǎn),從而為腺病毒介導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療外周神經(jīng)損傷提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1 將已經(jīng)包裝好的含有LacZ基因的腺病毒載體質(zhì)粒在感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增,從而得到足夠轉(zhuǎn)染計(jì)量的質(zhì)粒。收集擴(kuò)增質(zhì)粒并于-20℃凍存待用。
　　 2 復(fù)蘇HEK-293細(xì)胞,在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)2-3天換液。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng),當(dāng)細(xì)胞密度接近50％時(shí)傳代,注意早期傳代細(xì)胞的凍存。
　　

5、 3 擴(kuò)增后的質(zhì)粒使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,包裝帶有LacZ基因的重組腺病毒,在-70℃和37℃溫度下通過(guò)反復(fù)凍融提純腺病毒。
　　 4 病毒擴(kuò)增后在96孔板中感染培養(yǎng)好的HEK-293細(xì)胞,在顯微鏡下可觀察到293細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象,利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測(cè)定病毒滴度。
　　 5 將制備好的腺病毒2ul導(dǎo)入大鼠脊髓腰膨大節(jié)段,7天后取材,切成40μm的連續(xù)橫切片,37℃下溫箱內(nèi)0.1

6、％X-gal染液染色4h,挑選有陽(yáng)性反應(yīng)的切片貼片、中性紅復(fù)染、封片。
　　 結(jié)果:
　　 1 HEK-293細(xì)胞呈梭形,多觸角,貼壁強(qiáng)度小,細(xì)胞之間通過(guò)觸角相互連接,傾向于形成單層細(xì)胞。
　　 2 重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞3天后,經(jīng)4％多聚甲醛液固定20分鐘及0.1％X-gal溶液染色4小時(shí),在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞藍(lán)染情況,即檢測(cè)到LacZ基因的表達(dá),細(xì)胞表達(dá)出攜帶目的基因的腺病毒顆粒,對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞

7、藍(lán)染情況。
　　 3 脊髓橫切片中,LacZ基因陽(yáng)性表達(dá)的藍(lán)染細(xì)胞多位于脊髓前角,以注射側(cè)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量為多。濃密的藍(lán)染使陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)清晰,很容易辨認(rèn)出這些細(xì)胞是脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和周圍的膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1 保持HEK-293細(xì)胞在最適宜生長(zhǎng)條件,有助于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及病毒的成功制備。
　　 2 轉(zhuǎn)染后反復(fù)凍融提純病毒,重復(fù)感染293細(xì)胞,在排除其他感染的情況下細(xì)胞死亡,初步證明腺病毒能在細(xì)胞