攜帶LacZ基因腺病毒載體示蹤大鼠上肢神經(jīng)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的攜帶LacZ基因的腺病毒載體(AdLacZ)是一種有效的神經(jīng)示蹤劑，它在示蹤神經(jīng)通路中的應(yīng)用已經(jīng)成為研究神經(jīng)纖維聯(lián)系的重要技術(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)以AdLacZ基因作為神經(jīng)示蹤劑，通過(guò)其在神經(jīng)系統(tǒng)特異性、高效的表達(dá)，根據(jù)所示蹤的神經(jīng)軸突的走行及其運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元在脊髓和DRGs的范圍分析神經(jīng)軸突的來(lái)源。從損傷的大鼠尺神經(jīng)、正中神經(jīng)導(dǎo)入AdLacZ，通過(guò).AdLacZ及其表達(dá)產(chǎn)物在尺神經(jīng)、正中神經(jīng)的傳遞，探討AdLacZ特異、高效和安全的轉(zhuǎn)染

2、受損傷的尺神經(jīng)、正中神經(jīng)及其靶神經(jīng)元，研究AdLacZ示蹤大鼠尺神經(jīng)、正中神經(jīng)軸突及其靶運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)神經(jīng)元的過(guò)程，掌握AdLacZ在周圍神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的規(guī)律和特點(diǎn)。 方法選用7周齡健康雌性Wister大鼠240只。隨機(jī)分成A、B兩組，每組120只。A組在正中神經(jīng)導(dǎo)入AdLacZ為AdLacZ-M組，B組在尺神經(jīng)導(dǎo)入AdLacZ為AdLacZ-U組。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/噻拉嗪(75-100mg±5mg/kg)麻醉成功后，分別

3、在尺神經(jīng)或正中神經(jīng)與背闊肌肌腱交叉部位遠(yuǎn)端3mm處將其切斷，將2μl(2×107pfu) AdLacZ滴在神經(jīng)近側(cè)斷端，然后用10-0的無(wú)創(chuàng)線吻合神經(jīng)斷端，閉合傷口。在轉(zhuǎn)染后7周內(nèi)24個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)取出C4-Th2脊髓節(jié)段、DRGs連同臂叢神經(jīng)，將脊髓和DRGs切片后行X-gal染色和組化染色，臂叢的整個(gè)標(biāo)本行X-gal染色后切片。計(jì)數(shù)被標(biāo)記的脊髓和DRGs神經(jīng)元數(shù)目；兩組分之內(nèi)別組比較每一組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元的數(shù)目差異，兩組之間

4、分別比較運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目的差異及感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)的差異。觀察被標(biāo)記的脊髓和DRGs神經(jīng)元的部位及其范圍，比較兩組被標(biāo)記的部位及其范圍的異同。比較觀察AdLacZ轉(zhuǎn)基因表達(dá)在脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、DRGs神經(jīng)元及正中神經(jīng)、尺神經(jīng)的最早時(shí)間、高峰時(shí)間及持續(xù)時(shí)間。結(jié)果AdLacZ基因作為神經(jīng)示蹤劑，在尺神經(jīng)、正中神經(jīng)能夠特異性、高效的表達(dá)，動(dòng)態(tài)示蹤轉(zhuǎn)基因表達(dá)的全過(guò)程。轉(zhuǎn)基因表達(dá)僅限于感染AdLacZ的同側(cè)神經(jīng)。AdLacZ所導(dǎo)入尺神經(jīng)、正中神經(jīng)同側(cè)的

5、脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和DRGs感覺(jué)神經(jīng)元被轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物β-gal標(biāo)記；LacZ-U組被標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)均少于LacZ-M組(P＜0.01)。LacZ-U和LacZ-M組所標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)均少于感覺(jué)神經(jīng)元數(shù)(P＜0.01)，由尺神經(jīng)、正中神經(jīng)所標(biāo)記的神經(jīng)元分別在C7～Th1及C6～Th1節(jié)段；分別在轉(zhuǎn)染后第2天或第3天達(dá)高峰，高峰期分別持續(xù)至第5天或第7天，以后逐漸下降，都在轉(zhuǎn)染后3周左右消失。 兩組體視顯微鏡下觀察可

6、見(jiàn)DRGs、根絲、前后根、脊神經(jīng)、神經(jīng)干及神經(jīng)吻合口近遠(yuǎn)端在病毒轉(zhuǎn)染后由近及遠(yuǎn)順序被標(biāo)記。從神經(jīng)干導(dǎo)入載體部位至根絲入脊髓部位的距離平均26mm，至DRGs的距離平均23mm。轉(zhuǎn)染后3d可見(jiàn)已經(jīng)有少數(shù)軸突由根絲順行標(biāo)記至神經(jīng)吻合口部位，術(shù)后8天可見(jiàn)到吻合口遠(yuǎn)端再生軸突被標(biāo)記，6周后神經(jīng)干藍(lán)染消失。由尺神經(jīng)轉(zhuǎn)染的標(biāo)本，被標(biāo)記的軸突由C7～Th1節(jié)段發(fā)出，其中C8、Th1神經(jīng)根染色最深。由正中神經(jīng)轉(zhuǎn)染的標(biāo)本，被標(biāo)記的軸突由C6～Th1節(jié)段發(fā)

7、出，其中C7、C8神經(jīng)根染色最深。結(jié)論通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可知AdLacZ基因是一種有效的神經(jīng)示蹤劑，能從遠(yuǎn)距離特異、高效地逆行標(biāo)記尺神經(jīng)、正中神經(jīng)的靶神經(jīng)元，通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其產(chǎn)物然后又有效的順行標(biāo)記神經(jīng)突起及神經(jīng)根軸突。AdLacZ還具有高效示蹤周圍神經(jīng)及吻合口遠(yuǎn)端再生神經(jīng)軸突的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)還能了解到AdLacZ及其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在神經(jīng)通路中運(yùn)輸?shù)膭?dòng)態(tài)過(guò)程：首先，AdLacZ通過(guò)神經(jīng)軸突軸漿的逆行運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)元，AdLacZ高效表達(dá)，標(biāo)記該神經(jīng)元