攜帶可調控β-內啡肽基因的腺病毒治療疼痛的研究.pdf

1、研究背景及目的: 前期研究證實，椎管內單次注射攜帶神經(jīng)生長因子前導肽-β-內啡肽融合基因（NEP）的第一代腺病毒能夠有效減輕神經(jīng)病理性疼痛，但是持續(xù)表達的β-內啡肽是否會出現(xiàn)蓄積過量仍有疑慮，而且第一代腺病毒免疫原性高，β-內啡肽無法長期表達。因此，本實驗中我們擬構建RU486可調控NEP基因的第一代腺病毒，并進行體外驗證；同時試行構建RU486可調控NEP基因的第三代腺病毒載體。 方法: 1.構建由RU486

2、可調控NEP基因的腺病毒穿梭質粒pDC312-RUNEP，同時分別構建攜帶報告基因RFP或 LUC質粒pDC312-RURED與pDC312-RULUC，以及僅攜帶NEP的穿梭質粒pDC316-NEP； 2.利用AdMAXTM 系統(tǒng)，重組得到第一代腺病毒Ad-RUNEP和Ad-NEP，進行擴增、純化和測定滴度； 3.穿梭質粒pDC312-RURED和pDC312-RULUC分別脂質體轉染HEK293細胞，檢測RU48

3、6調控系統(tǒng)的功能； 4.腺病毒Ad-RUNEP感染NIH3T3 和A431，加入不同劑量梯度的RU486，兩天后去除RU486誘導， ELISA定量檢測加入RU486之后第1、2和4天每一樣本培養(yǎng)上清中β-內啡肽的表達含量，使用Ad-NEP作對照； 5.利用Gateway○R系統(tǒng)同源重組法，重組構建第三代腺病毒載體pGL-RUNEP； 6.利用SPSS統(tǒng)計軟件分析所得數(shù)據(jù)結果。 結果: 1.

4、得到滴度為2.25×1010PFU/ml的第一代腺病毒Ad-RUNEP； 2.RU486調控系統(tǒng)的檢測： RFP和LUC的表達都會隨RU486呈劑量依賴性增加； 3.ELISA定量檢測：當RU486劑量達10-7mol/l時，β-內啡肽的表達也達到最大，并且隨RU486的給藥停止而減弱； 4.成功構建得第三代腺病毒載體pGL-RUNEP。 結論: 我們已成功構建攜帶RU486可調控NEP基