攜帶p53基因的雙調(diào)控減毒增殖腺病毒治療肝癌的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的： 肝細胞肝癌(簡稱肝癌)發(fā)病率位居人類惡性腫瘤的第5位，每年大約有100萬新發(fā)病例，其中45﹪在中國大陸，每年約有11萬人死于肝癌，位居惡性腫瘤死亡率的第2位，雖然肝切除術和肝移植有可能治愈肝癌，但大部分患者(約60﹪～80﹪)在臨床診斷時已失去手術根治機會，根據(jù)2005年美國癌癥協(xié)會調(diào)查資料顯示，總體肝癌的5年生存率僅為8.3﹪。因此，迫切需要探索新的肝癌治療方法來提高療效。 基因-病毒治療作為一種新的

2、腫瘤治療手段受到愈來愈多的關注，選擇適當?shù)陌邢驒C制提高病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染率、保證抗癌基因正常表達和對腫瘤細胞殺傷的同時，對機體的正常細胞沒有破壞性的影響，是基因-病毒治療系統(tǒng)能否應用于臨床的關鍵所在。 我們利用腫瘤的無限生長和缺氧微環(huán)境兩大特性為雙靶點，通過基因重組技術對腺病毒進行改造，采用了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子調(diào)控腺病毒早期表達基因E1a，缺氧反應啟動子(HRE)調(diào)控E1b，同時在E1a下游插入外源目的基因p53，

3、構建出攜帶p53基因由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和缺氧反應啟動子雙調(diào)控減毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，通過體外實驗對CNHK500-p53的選擇性殺傷肝癌細胞株的能力進行評估，進一步觀察CNHK500-p53對裸鼠肝癌移植瘤的治療效果，并對其抗癌機制進行初步探討。 方法： 1.攜帶p53基因由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和缺氧反應啟動子雙調(diào)控減毒增殖型腺病毒(CNHK500-p53)的構建和制備利用基因重組技術構建由hTE

4、RT啟動子調(diào)控E1a基因及缺氧反應啟動子調(diào)控E16基因表達并攜帶p53基因的減毒增殖型腺病毒載體質(zhì)粒pSG500-p53。將pSG500-p53與含有5型腺病毒載體右臂的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細胞，通過細胞內(nèi)DNA同源重組獲得新的重組病毒，PCR法對重組病毒DNA進行鑒定，重組正確的病毒命名為CNHK500-p53。病毒在293細胞中反復擴增到需要量，氯化銫梯度離心法純化病毒，用TCID50方法測得重組腺病毒滴度達到2.0×10<

5、'10>pfu/ml。凍存?zhèn)溆谩?2.CNHK500-p53體外抗腫瘤實驗CNHKS00-p53 E1A、E1B蛋白和p53表達的檢測及定量分析：Western blot法檢測CNHK500-p53對HepG2、Hep3B細胞和BJ細胞感染后病毒蛋白E1A、E1B及抑癌基因p53的表達，ELISA定量檢測抑癌基因p53的表達。 病毒增殖實驗：分別用不同腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、WAd5感染不同來源

6、的腫瘤細胞株和正常細胞株，觀察不同時相(Oh、24h、48h、96h)的病毒增殖情況，50﹪組織培養(yǎng)感染劑量(50﹪TCID)法測定病毒滴度并計算出在各種細胞中的增殖倍數(shù)。觀察它們在不同細胞間的增殖差異。 熒光顯微鏡鏡檢觀察病毒增殖情況：將攜帶綠色熒光蛋白報告基因的腺病毒CNHK500-EGFP和Ad-EGFP分別轉(zhuǎn)染正常細胞BJ及腫瘤細胞Bel-7402、HepG2，轉(zhuǎn)染后第3、7、10天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情

7、況。 細胞病理效應(CPE)：依次將腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53按不同MOI值(MOI=0.01、0.1、1、10、100)感染不同的肝癌細胞株和正常細胞株，觀察和比較CNHK500-p53對各種細胞的殺傷效應。 病毒殺傷實驗(MTT)：按不同的MOI值將CNHK500-p53感染肝癌細胞株HepG2、Bel-7402及正常細胞株BJ細胞，計算出IC50值(50﹪抑制強度所需的最小藥物濃度)

8、。檢測病毒對各種細胞的殺傷效率，并分別與CNHK500、Ad-p53相比較。 3.CNHK500-p53治療裸鼠移植瘤的動物實驗瘤內(nèi)注射CNHK500-p53治療裸鼠HepG2移植瘤： 在Balb/C小鼠右側(cè)肋腹部皮下建立HepG2移植瘤模型，隨機將成瘤裸鼠分為四組，包括CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53三個治療組和PBS緩沖液陰性對照組(n=9)，采用單盲對照方法進行試驗，給藥途徑為直接瘤內(nèi)注射，觀察

9、和比較各治療組對肝癌生長的作用；取腫瘤標本常規(guī)病理觀察各組腫瘤生長情況；透射電鏡觀察病毒在移植瘤中的增殖情況。結果統(tǒng)計分析采用非配對t檢驗。 結果： 1.所構建的重組病毒經(jīng)PCR鑒定，證實重組正確，病毒純化后命名為CNHK500-p53；經(jīng)Western-Blot檢測E1A、E1B和p53顯示：E1A蛋白表達存在細胞差異性，在腫瘤細胞(HepG2、Hep3B)中可檢測到腺病毒早期蛋白E1A的表達，而在正常細胞中(BJ)中

10、則難以檢測到E1A的表達；重組病毒CNHK500-p53的E1B蛋白表達受到氧濃度條件的限制，當肝癌細胞株Hep3B、HepG2在MOI=1時感染CNHK500-p53，在常氧狀態(tài)下(21﹪O<,2>)難以檢測到E1B的表達，而在相同MOI值，對感染CNHK500-p53的細胞進行缺氧(<1﹪02)處理，可明顯檢測到E1B蛋白的表達，而感染CNHK500-p53的正常細胞無論常氧還是缺氧狀態(tài)都難以檢測到E1B蛋白的表達。在CNHK500

11、-p53和Ad-p53感染的HepG2細胞上清液中均存在p53蛋白陽性表達。 2．CNHK500-p53和CNHK500在肝癌細胞中能隨時間而大量復制增殖。而在正常細胞中基本不增殖，腫瘤選擇性增殖能力明顯優(yōu)于WtAd5。在缺氧條件下，CNHK500-p53和CNHK500在腫瘤細胞和正常細胞內(nèi)的增殖較常氧狀態(tài)下均有增強，但在正常細胞中的增殖仍遠遠弱于在腫瘤細胞中的增殖。 3．CNHK500-GFP在正常BJ細胞中綠色熒光

12、持續(xù)單簇、分散存在；而在腫瘤細胞中隨著時間延長，綠色熒光的表達由散在、單個存在逐漸變?yōu)閺V泛、集中、融合存在，直至10天時熒光漸漸消散、淡去；Ad-GFP在正常BJ細胞和腫瘤細胞中綠色熒光持續(xù)單簇、分散存在；反映出CNHK500-GFP在腫瘤細胞中迅速復制、增殖，溶解細胞的過程。 4．CNHK500-p53對Bel-7402細胞具有很強的殺傷能力，在MOI=0.01時即可殺傷全部腫瘤細胞；在MOI=10時可以殺傷全部的HepG2肝

13、癌細胞；而對正常細胞殺傷能力明顯減弱，在MOI=100時感染BJ細胞，對該細胞仍無明顯殺傷作用，直觀地反映出CNHK500-p53對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用。 5．在肝癌細胞株HepG2和Bel-7402中，CNHK500-p53的IC<,50>分別為0.012和0.28，而在正常細胞株BJ中，IC<,50>為352.1，量化地反映出CNHK500-p53選擇性殺傷腫瘤細胞。 6.實驗結果表明三個治療組同陰性對照組相比，

14、能明顯的抑制腫瘤生長，具有顯著差異(P<0.05)。在三個治療組中，CNHK500-p53療效明顯優(yōu)于CNHK500和Ad-p53治療組(P<0.05)。常規(guī)病理切片檢查發(fā)現(xiàn)治療組同對照組相比，腫瘤組織中有大量壞死灶出現(xiàn)，透射電鏡檢查檢測到病毒治療組的瘤體組織內(nèi)腺病毒顆粒和晶格形成，說明增殖腺病毒能在腫瘤細胞內(nèi)增殖，抑制移植瘤的生長。 結論： 1.本研究成功構建了由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子調(diào)控Ela基因、人缺氧反應啟動子調(diào)

15、控Elb基因并攜帶p53基因的減毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，并經(jīng)PCR鑒定重組腺病毒構建正確。 2.體外實驗表明重組病毒CNHK500-p53可以選擇性地在端粒酶陽性的肝癌細胞中增殖、殺傷，而在正常細胞中基本不增殖，具有選擇性腫瘤細胞增殖能力，對Bel-7402和HepG2的殺傷作用明顯優(yōu)于CNHK500和Ad-p53。病毒基因組外源性插入p53基因并不影響重組腺病毒的選擇性復制和溶瘤作用。 3.體外實驗表明：