攜帶p53基因的雙調(diào)控減毒增殖腺病毒治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的： 肝細(xì)胞肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)發(fā)病率位居人類惡性腫瘤的第5位，每年大約有100萬(wàn)新發(fā)病例，其中45﹪在中國(guó)大陸，每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，位居惡性腫瘤死亡率的第2位，雖然肝切除術(shù)和肝移植有可能治愈肝癌，但大部分患者(約60﹪～80﹪)在臨床診斷時(shí)已失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，根據(jù)2005年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查資料顯示，總體肝癌的5年生存率僅為8.3﹪。因此，迫切需要探索新的肝癌治療方法來(lái)提高療效。 基因-病毒治療作為一種新的

2、腫瘤治療手段受到愈來(lái)愈多的關(guān)注，選擇適當(dāng)?shù)陌邢驒C(jī)制提高病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染率、保證抗癌基因正常表達(dá)和對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞沒(méi)有破壞性的影響，是基因-病毒治療系統(tǒng)能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵所在。 我們利用腫瘤的無(wú)限生長(zhǎng)和缺氧微環(huán)境兩大特性為雙靶點(diǎn)，通過(guò)基因重組技術(shù)對(duì)腺病毒進(jìn)行改造，采用了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒早期表達(dá)基因E1a，缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子(HRE)調(diào)控E1b，同時(shí)在E1a下游插入外源目的基因p53，

3、構(gòu)建出攜帶p53基因由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子雙調(diào)控減毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)CNHK500-p53的選擇性殺傷肝癌細(xì)胞株的能力進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)一步觀察CNHK500-p53對(duì)裸鼠肝癌移植瘤的治療效果，并對(duì)其抗癌機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 1.攜帶p53基因由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子和缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子雙調(diào)控減毒增殖型腺病毒(CNHK500-p53)的構(gòu)建和制備利用基因重組技術(shù)構(gòu)建由hTE

4、RT啟動(dòng)子調(diào)控E1a基因及缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控E16基因表達(dá)并攜帶p53基因的減毒增殖型腺病毒載體質(zhì)粒pSG500-p53。將pSG500-p53與含有5型腺病毒載體右臂的質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)DNA同源重組獲得新的重組病毒，PCR法對(duì)重組病毒DNA進(jìn)行鑒定，重組正確的病毒命名為CNHK500-p53。病毒在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增到需要量，氯化銫梯度離心法純化病毒，用TCID50方法測(cè)得重組腺病毒滴度達(dá)到2.0×10<

5、'10>pfu/ml。凍存?zhèn)溆谩?2.CNHK500-p53體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)CNHKS00-p53 E1A、E1B蛋白和p53表達(dá)的檢測(cè)及定量分析：Western blot法檢測(cè)CNHK500-p53對(duì)HepG2、Hep3B細(xì)胞和BJ細(xì)胞感染后病毒蛋白E1A、E1B及抑癌基因p53的表達(dá)，ELISA定量檢測(cè)抑癌基因p53的表達(dá)。 病毒增殖實(shí)驗(yàn)：分別用不同腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、WAd5感染不同來(lái)源

6、的腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株，觀察不同時(shí)相(Oh、24h、48h、96h)的病毒增殖情況，50﹪組織培養(yǎng)感染劑量(50﹪TCID)法測(cè)定病毒滴度并計(jì)算出在各種細(xì)胞中的增殖倍數(shù)。觀察它們?cè)诓煌?xì)胞間的增殖差異。 熒光顯微鏡鏡檢觀察病毒增殖情況：將攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的腺病毒CNHK500-EGFP和Ad-EGFP分別轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞BJ及腫瘤細(xì)胞Bel-7402、HepG2，轉(zhuǎn)染后第3、7、10天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情

7、況。 細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)：依次將腺病毒CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53按不同MOI值(MOI=0.01、0.1、1、10、100)感染不同的肝癌細(xì)胞株和正常細(xì)胞株，觀察和比較CNHK500-p53對(duì)各種細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 病毒殺傷實(shí)驗(yàn)(MTT)：按不同的MOI值將CNHK500-p53感染肝癌細(xì)胞株HepG2、Bel-7402及正常細(xì)胞株BJ細(xì)胞，計(jì)算出IC50值(50﹪抑制強(qiáng)度所需的最小藥物濃度)

8、。檢測(cè)病毒對(duì)各種細(xì)胞的殺傷效率，并分別與CNHK500、Ad-p53相比較。 3.CNHK500-p53治療裸鼠移植瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)瘤內(nèi)注射CNHK500-p53治療裸鼠HepG2移植瘤： 在Balb/C小鼠右側(cè)肋腹部皮下建立HepG2移植瘤模型，隨機(jī)將成瘤裸鼠分為四組，包括CNHK500-p53、CNHK500、Ad-p53三個(gè)治療組和PBS緩沖液陰性對(duì)照組(n=9)，采用單盲對(duì)照方法進(jìn)行試驗(yàn)，給藥途徑為直接瘤內(nèi)注射，觀察

9、和比較各治療組對(duì)肝癌生長(zhǎng)的作用；取腫瘤標(biāo)本常規(guī)病理觀察各組腫瘤生長(zhǎng)情況；透射電鏡觀察病毒在移植瘤中的增殖情況。結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1.所構(gòu)建的重組病毒經(jīng)PCR鑒定，證實(shí)重組正確，病毒純化后命名為CNHK500-p53；經(jīng)Western-Blot檢測(cè)E1A、E1B和p53顯示：E1A蛋白表達(dá)存在細(xì)胞差異性，在腫瘤細(xì)胞(HepG2、Hep3B)中可檢測(cè)到腺病毒早期蛋白E1A的表達(dá)，而在正常細(xì)胞中(BJ)中

10、則難以檢測(cè)到E1A的表達(dá)；重組病毒CNHK500-p53的E1B蛋白表達(dá)受到氧濃度條件的限制，當(dāng)肝癌細(xì)胞株Hep3B、HepG2在MOI=1時(shí)感染CNHK500-p53，在常氧狀態(tài)下(21﹪O<,2>)難以檢測(cè)到E1B的表達(dá)，而在相同MOI值，對(duì)感染CNHK500-p53的細(xì)胞進(jìn)行缺氧(<1﹪02)處理，可明顯檢測(cè)到E1B蛋白的表達(dá)，而感染CNHK500-p53的正常細(xì)胞無(wú)論常氧還是缺氧狀態(tài)都難以檢測(cè)到E1B蛋白的表達(dá)。在CNHK500

11、-p53和Ad-p53感染的HepG2細(xì)胞上清液中均存在p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)。 2．CNHK500-p53和CNHK500在肝癌細(xì)胞中能隨時(shí)間而大量復(fù)制增殖。而在正常細(xì)胞中基本不增殖，腫瘤選擇性增殖能力明顯優(yōu)于WtAd5。在缺氧條件下，CNHK500-p53和CNHK500在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的增殖較常氧狀態(tài)下均有增強(qiáng)，但在正常細(xì)胞中的增殖仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于在腫瘤細(xì)胞中的增殖。 3．CNHK500-GFP在正常BJ細(xì)胞中綠色熒光

12、持續(xù)單簇、分散存在；而在腫瘤細(xì)胞中隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綠色熒光的表達(dá)由散在、單個(gè)存在逐漸變?yōu)閺V泛、集中、融合存在，直至10天時(shí)熒光漸漸消散、淡去；Ad-GFP在正常BJ細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中綠色熒光持續(xù)單簇、分散存在；反映出CNHK500-GFP在腫瘤細(xì)胞中迅速?gòu)?fù)制、增殖，溶解細(xì)胞的過(guò)程。 4．CNHK500-p53對(duì)Bel-7402細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷能力，在MOI=0.01時(shí)即可殺傷全部腫瘤細(xì)胞；在MOI=10時(shí)可以殺傷全部的HepG2肝

13、癌細(xì)胞；而對(duì)正常細(xì)胞殺傷能力明顯減弱，在MOI=100時(shí)感染BJ細(xì)胞，對(duì)該細(xì)胞仍無(wú)明顯殺傷作用，直觀地反映出CNHK500-p53對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用。 5．在肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402中，CNHK500-p53的IC<,50>分別為0.012和0.28，而在正常細(xì)胞株BJ中，IC<,50>為352.1，量化地反映出CNHK500-p53選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。 6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三個(gè)治療組同陰性對(duì)照組相比，

14、能明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)，具有顯著差異(P<0.05)。在三個(gè)治療組中，CNHK500-p53療效明顯優(yōu)于CNHK500和Ad-p53治療組(P<0.05)。常規(guī)病理切片檢查發(fā)現(xiàn)治療組同對(duì)照組相比，腫瘤組織中有大量壞死灶出現(xiàn)，透射電鏡檢查檢測(cè)到病毒治療組的瘤體組織內(nèi)腺病毒顆粒和晶格形成，說(shuō)明增殖腺病毒能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，抑制移植瘤的生長(zhǎng)。 結(jié)論： 1.本研究成功構(gòu)建了由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子調(diào)控Ela基因、人缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)

15、控Elb基因并攜帶p53基因的減毒增殖型腺病毒CNHK500-p53，并經(jīng)PCR鑒定重組腺病毒構(gòu)建正確。 2.體外實(shí)驗(yàn)表明重組病毒CNHK500-p53可以選擇性地在端粒酶陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞中增殖、殺傷，而在正常細(xì)胞中基本不增殖，具有選擇性腫瘤細(xì)胞增殖能力，對(duì)Bel-7402和HepG2的殺傷作用明顯優(yōu)于CNHK500和Ad-p53。病毒基因組外源性插入p53基因并不影響重組腺病毒的選擇性復(fù)制和溶瘤作用。 3.體外實(shí)驗(yàn)表明：