非增殖性腺病毒攜帶全長抗體Cetuximab的腫瘤基因治療的研究.pdf

1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文非增殖性腺病毒攜帶全長抗體Cetuximab的腫瘤基因治療的研究姓名：劉海平申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：錢其軍20100301浙江理工大學(xué)碩士論文1、表達(dá)全長抗體Cetuximab(C225)的腺病毒載體Ad5C225、Ad339NC225和AdSUDITR—NC225的構(gòu)建及制備：(1)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的Cetuximab抗體的全長基因和新的改變過密碼子后的Cet

2、uximab抗體的全長基因，并分別在輕鏈和重鏈基因的前端加上分泌型信號肽。(2)以上抗體Cetuximab基因分別插入到腺病毒載體pDC339和pDC31lITR中，得到腺病毒穿梭載體pDC339C225和pDC339NC225，pDC311一ITRNC225與骨架載體pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，lO天后出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過逐步病毒空斑純化，PCR鑒定正確的腺病毒分別命名為Ad5一C225，Ad5NC225，Ad5一ITRNC225。經(jīng)

3、293細(xì)胞擴(kuò)增、HPLC法純化、qRTPCR(實時熒光定量PCR)的方法測重組腺病毒滴度和TCIDso鋇Ij得病毒滴度。2、表達(dá)全長抗體Cetuximab的腺病毒載體Ad5HerAd5NC225，AdSITRNC225的體外實驗：1)Ad—C225、Ad339NC225、Ad5UDITRNC225感染293細(xì)胞，ELISA測定感染72小時后Cetuximab表達(dá)量分別為(252生3)ng／ml、3176a：5ng／ml和4259士5ng

4、／ml；但是它們在L02細(xì)胞中基本不表達(dá)抗體。2)抗體的生物學(xué)活性檢測：問接免疫熒光實驗顯示AdC225、Ad339NC225、Ad5一UDITRNC225在293細(xì)胞中表達(dá)的抗體與HERl抗原有很好的特異性結(jié)合能力，與商品化抗體Cetuximab相似；WesternBlot實驗顯示3個重組腺病毒載體表達(dá)的抗體輕鏈和重鏈與商品化Cetuximab的輕、重鏈相近，且輕鏈和重鏈的平衡性也比較好，說明表達(dá)的抗體可以形成完整的全長抗體。結(jié)論：本