腫瘤限制性復制腺病毒與殺基因肝癌基因治療.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學博士學位論文腫瘤限制性復制腺病毒與自殺基因肝癌基因治療姓名：李鋒申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：錢關祥2003.5.1P落第二壓科土事諺t雪謹論土將PNP基因通過12個glycineLinker連接于CDglyTK融合基因上，構建出pcDNAPNPglycDglyTK真核表達載體，并利用脂質體進行轉染三種肝癌細胞株HepG2，BEL7402和SMMC7721。我們首先通過RTPCR、Northern

2、，Western等方法驗證了融合基因的表達，證明我們構建的融合基因可通過脂質體有效介導在細胞中表達。并用MTT實驗驗證融合基因的細胞毒效應。結果表明融合基因在三種前藥單獨添加時均可發(fā)生腫瘤殺傷效應，三種藥物聯(lián)合應用時其具有明顯的協(xié)同效應。對AFP的細胞株BEL7402和HepG2在前藥濃度為fludarabine05Itg／ml，5FCl001xg／ml，GCVl01ag／ml時，可明顯抑制腫瘤的增殖。據(jù)此我們選擇了該濃度作為腫瘤細胞殺

3、傷的依據(jù)，進一步作了細胞凋亡實驗，我們發(fā)現(xiàn)在該濃度的前藥作用下細胞可出現(xiàn)明顯的凋亡，三種細胞BEL7402、SMMC7721、HepG2凋亡細胞百分比分別為6265％、641％、5634％，較單一的PNP基因作用有明顯提高。我們也觀察到，在PNP／fludarabine系統(tǒng)作用相對較弱的SMMC7721細胞中，融合基因加三種前藥的療效明顯增強。上述實驗結果表明我們構建的融合基因具有良好的腫瘤殺傷效應。由于腺病毒載體的自身特點，其在腫瘤基

4、因治療中倍受重視。我們采用Stratagen公司的第二代細菌內同源重組法構建腺病毒的方法成功構建了腺病毒載體AdCMVPNPglyCDglyTK，在此基礎上我們對HepG2和Hep3B細胞進行了細胞增殖和殺傷的研究，結果表明AD—CMVPNPglyCDglyTK同樣具有良好的腫瘤殺傷和抑制腫瘤增殖的效應。這一步工作為PNPglyCDglyTK融合基因進一步的體內實驗研究奠定了良好的基礎。三、AFP啟動子活性研究本研究中設計了四種AFP反

5、應元件，分別是帶增強子元件的突變型和野生型AFPTRE和不帶增強子成分的突變型和野生型AFP啟動子調控的EGFP表達載體和luceferase表達載體，在多種細胞中驗證了這四種反應元件的轉錄活性。結果表明帶增強子成分的AFPTRE較無增強子成分的AFPTRE在AFP高表達的細胞株Hep3B、HepG2和BEL7402中其活性顯著得到增強，但在AFP一的其他多種細胞株中四種AFPTRE均只有極低的活性。突變型和野生型的AFPTRE之間并未