雙腺病毒介導(dǎo)的Trail基因治療腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)中,以trail分子作為治療分子,以感染效率較高的腺病毒作為載體,對(duì)HepG2、Hep3B、Hela和A549等腫瘤細(xì)胞和chang liver正常細(xì)胞作了誘導(dǎo)凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究.雖然trail分子能夠選擇性地誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,但是腺病毒的包裝細(xì)胞,293細(xì)胞也是一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的永生型細(xì)胞,也有可能在包裝過(guò)程中被trail分子誘導(dǎo)發(fā)生凋亡.為避免包裝的中斷,我們同時(shí)應(yīng)用了"GAL4/VP16融合轉(zhuǎn)錄因子、G5E1b-TA

2、TA啟動(dòng)子"系統(tǒng)對(duì)trail基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,使其在包裝階段低表達(dá),在感染殺傷階段高表達(dá).該實(shí)驗(yàn)包括以下三部分內(nèi)容:第一部分 trail基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)腫瘤細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)研究 利用RT-PCR方法從胎兒脾臟組織中擴(kuò)增出人trail基因的全長(zhǎng)cDNA,構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3-trail,先應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染HepG2、Hep3B、Hela和A549等腫瘤細(xì)胞,同時(shí)以pcDNA<,3>轉(zhuǎn)染同種細(xì)胞作為陰性對(duì)照.通過(guò)

3、MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞相對(duì)存活率,初步觀察trail分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用.第二部分 GAL4/VP16融合轉(zhuǎn)錄因子活性的研究 構(gòu)建含有融合轉(zhuǎn)錄因子GAL4/VP16的表達(dá)載體pcDNA<,3>-GV和含有受G5E1b-TATA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因EGFP的表達(dá)載體pGL<,3>-G5E1b-TATA-EGFP,應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將這兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2、Hep3B、Hela和A549等腫瘤細(xì)胞和293細(xì)胞,同時(shí)以pGL<,3

4、>-G5E1b-TATA-EGFP單獨(dú)轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞作為陰性對(duì)照,而以pcDNA3-EGFP單獨(dú)轉(zhuǎn)染同種細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照.第三部分 雙腺病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)研究 構(gòu)建了Adpshuttle-G5E1b-TATA-trail-BGHpA和Adpshuttle-cmv-GV兩種腺病毒載體.以相同的感染復(fù)數(shù)共同感染HepG2、Hep3B、Hela和A549等腫瘤細(xì)胞和chang liver正常細(xì)胞.通過(guò)RT-PCR,