人FL的甲醇酵母表達(dá)及腺病毒介導(dǎo)的免疫基因治療.pdf

1、人FL(flt3 ligand)是近年發(fā)現(xiàn)的重要造血細(xì)胞因子，其功能類似于hSCF，主要作 用于早期原始的干／祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化，與其它細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，可產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。與hSCF不同的是，hFL對(duì)肥大細(xì)胞沒有作用，沒有種屬特異性，并且可顯著刺激樹突狀細(xì)胞(DC)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的增殖。這些功能使FL在造血系統(tǒng)原發(fā)性或繼發(fā)性損傷疾病的治療、造血干細(xì)胞移植，特別是在腫瘤免疫基因治療和免疫瘴苗制備等方面具有重要的潛在

2、應(yīng)用價(jià)值。DCs細(xì)胞作為功能最強(qiáng)的抗 原提呈細(xì)胞(APC)，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，能誘導(dǎo)非特異性先天免疫反應(yīng)和特異性獲得免疫反應(yīng)。利用FL擴(kuò)增DCs的抗腫瘤免疫治療效果，在動(dòng)物模型中已得到驗(yàn)證。本研究利用hFL能顯著刺激體內(nèi)DCs增殖的生物學(xué)特性，用基因工程方法表達(dá)重組hFL，對(duì)小鼠種植瘤進(jìn)行抑瘤效果試驗(yàn)，為進(jìn)一步研究hFL在腫瘤免疫治療中的有效作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本論文主要包括兩部分內(nèi)容： 一、應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)，表

3、達(dá)分泌性人FL(hFL)的K84E／Q122R突變體。hFL第84位和122位氨基酸的密碼子分別改造為E和R的密碼子，并在N端采用甲醇酵母偏愛密碼子，以提高h(yuǎn)FL的活性和表達(dá)量。將該突變體的基因克隆入酵母穿梭質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-hFL，電轉(zhuǎn)入甲醇酵母，用原位雙膜篩選法篩選獲得Mut<'+>及Mut<'s>高表達(dá)轉(zhuǎn)化子，分別進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)選并基本建立了分離純化rhFL的工藝，兩者最佳表達(dá)條件為：Mut<'+>轉(zhuǎn)化子用B

4、MMY培養(yǎng)基(pH6.0)，Mut<'s>轉(zhuǎn)化子用BMMP(pH6.0)，經(jīng)2％甲醇誘導(dǎo)96h。與Mut<'+>型相比，Mut<'s>轉(zhuǎn)化子在含營養(yǎng)和色素較少的BMM培養(yǎng)基中即有高表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物雜蛋白少，易于純化。重組hFL表達(dá)量達(dá)30mg／L。采用Q-FF分離→濃縮→Sephacryl S-200分離純化，步驟簡單有效?；厥章始s為20mg／L。用內(nèi)糖苷酶EndoH切除hFL N-糖鏈后，結(jié)果顯示hFL中除N-糖基化外，可能還有其他形

5、式的糖基化。純化的hFL經(jīng)Western印跡和N端 前10個(gè)氨基酸序列分析驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期一致，質(zhì)譜法測定其分子量為20～22kD。 生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用hFL可以顯著刺激小鼠骨髓有核細(xì)胞擴(kuò)增，與mGM-CSF聯(lián)用可以協(xié)同增強(qiáng)刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。 rhFL對(duì)鼠EL4淋巴瘤的抗腫瘤結(jié)果表明：小鼠皮下移植EL4淋巴瘤，連續(xù)注射14天hFL后，腫瘤比對(duì)照組減小，抑瘤率為25％左右。P<0.001，差別

6、具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 二，應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)hFL與hGM-CSF進(jìn)行抗腫瘤免疫基因治療。 應(yīng)用AdEasy系統(tǒng)，構(gòu)建和包裝了高表達(dá)hFL與hGM-CSF雙基因的重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF。感染293細(xì)胞，培養(yǎng)上清中hFL24n表達(dá)量可達(dá)96ng／ml，hGM-CSF24h表達(dá)量可達(dá)306ng/ml。體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，表達(dá)的hFL對(duì)小鼠骨髓有核細(xì)胞有明顯增殖作用，且呈劑效關(guān)系；表達(dá)的hGM-CSF對(duì)TF1

7、有明顯的刺激增殖作用，與對(duì)照品的增殖作用相似，小鼠體內(nèi)注射一次5×10<'9>pfu重組腺病毒．Ad-hFL-hGM-CSF，血清中hFL24h表達(dá)量可達(dá)25ng/ml，hGM-CSF 8h表達(dá)量可達(dá)3．3ng/ml。注射8天后，脾臟重量明顯增加，細(xì)胞數(shù)增多，DC數(shù)目顯著增加，為正常值的～50倍。在鼠皮下移植EIA淋巴瘤模型的治療實(shí)驗(yàn)中，注射四次．Ad-hFL-hGM-CSF，5×10<'9> pfu／次，腫瘤比對(duì)照組減小，抑瘤率為30

8、％，P值小于0．05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF對(duì)小鼠皮下移植EL4淋巴瘤具有明顯的抑制作用。創(chuàng)新點(diǎn)：我們改造了hFL編碼序列中2個(gè)氨基酸的密碼子，并在N端采用甲醇酵母偏愛密碼子，以提高h(yuǎn)FL的活性和表達(dá)量；聯(lián)合應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的人FL和人GM-CSF，在體內(nèi)擴(kuò)增DC的數(shù)量以抑制腫瘤生長，并且，經(jīng)我們改造過的腺病毒穿梭質(zhì)粒使hFL和hGM-CSF兩個(gè)目的基因在同一個(gè)表達(dá)載體中均獲得高效表達(dá)，這迄今尚未見