重組腺病毒介導(dǎo)的可調(diào)控人胰島素基因治療Ⅰ型糖尿病的實驗研究.pdf

1、近年來，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，在我國已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾患之后第三位重要的慢性非傳染性疾病。然而，現(xiàn)有的各種糖尿病的治療措施，均有一定的不足和局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療為糖尿病治療開辟了一條嶄新的途徑。胰島素基因治療可分為生殖細胞基因治療和體細胞基因治療兩大類，而體細胞基因治療從方法上又可分為回體轉(zhuǎn)移和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移兩種。由于技術(shù)上及倫理學(xué)上的障礙，生殖細胞基因治療目前只能用于實驗研究，不能

2、作為用于人類的一條治療途徑。而回體轉(zhuǎn)移法選用的靶細胞均是永生化細胞系，移植體內(nèi)后可能形成移植瘤，阻礙了其進一步的臨床應(yīng)用。體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移是基因治療糖尿病的最終目的。目前，利用基因轉(zhuǎn)移載體將胰島素基因直接導(dǎo)入體內(nèi)并使其表達成熟的胰島素已不是一件困難的事情，關(guān)鍵是在體細胞(非B細胞)中建立受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素分泌功能。另一方面，基因治療中還有一個不可忽視的關(guān)鍵問題就是轉(zhuǎn)移載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率。目前，基因治療中常用的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要包括非

3、病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)兩大類。非病毒載體系統(tǒng)雖然具有制備簡便，免疫原性較低，安全性較高等優(yōu)點，但其轉(zhuǎn)染效率低下、表達時間較短，很難進一步應(yīng)用于臨床實驗。而病毒載體系統(tǒng)，尤其是重組腺病毒，因其轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣泛、安全性高、易于制備較高滴度等優(yōu)點，正被越來越多地應(yīng)用于體外的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)的基因治療，是目前最常用的基因轉(zhuǎn)移載體之一。我們構(gòu)建了攜帶葡萄糖依賴性促胰島素多肽(Glucose-dependentinsulinotropic

4、polypeptide，GIP)啟動子控制下人胰島素基因的重組腺病毒，體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染胃腸道K細胞，使K細胞獲得受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素表達、分泌功能，探索一條胰島素轉(zhuǎn)基因治療的有效途徑，為糖尿病的基因治療走向臨床提供實驗研究基礎(chǔ)。 方法：我們首先采用細胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶GIP啟動子控制下的人胰島素基因的非增殖型腺病毒(Ad．GIP-hlns)，通過擴增和純化獲得病毒濃縮液。在體外實驗中，將病毒以不同的感染復(fù)數(shù)(Multipl

5、icityOfInfection，MOI)轉(zhuǎn)染STC．1細胞，檢測病毒的感染能力；以放射免疫法測定MOI=100時重組腺病毒轉(zhuǎn)染不同細胞、在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)液中胰島素的含量，來檢測GIP啟動子的細胞特異性與葡萄糖反應(yīng)性。通過RT-PCR檢測細胞中人胰島素基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，采用免疫組化與雙重免疫熒光定性檢測細胞中胰島素與GIP的共表達。然后，通過腸系膜上動脈將病毒導(dǎo)入糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察病毒轉(zhuǎn)染后糖尿病大鼠血糖、胰島素分泌及體重的變

6、化。 結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定，證實我們成功構(gòu)建了含有目的基因的重組腺病毒Ad．GIP-hIns。體外實驗證實腺病毒對STC-1細胞有較強的感染能力，且以MOI值為100時轉(zhuǎn)染效率最佳。以重組病毒轉(zhuǎn)染不同細胞，結(jié)果表明僅在STC．1細胞內(nèi)有胰島素的表達，且在轉(zhuǎn)染后第3天就進入表達高峰，一直持續(xù)至第七天；同時發(fā)現(xiàn)胰島素的表達量隨葡萄糖濃度升高而增加，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 RT-PCR和免疫組化分別從RNA與細胞內(nèi)蛋白水平驗證了轉(zhuǎn)

7、染后細胞內(nèi)有胰島素基因的轉(zhuǎn)錄與表達。經(jīng)腸系膜上動脈注入重組病毒，可以成功地轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠腸道的K細胞，使其產(chǎn)生血糖可調(diào)節(jié)性胰島素分泌，明顯改善了糖尿病大鼠的糖耐量情況，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時間內(nèi)得到一定水平的控制。 結(jié)論：我們構(gòu)建的攜帶目的基因的重組腺病毒，體外和體外實驗均可以轉(zhuǎn)染胃腸道K細胞，使其表達胰島素，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時間內(nèi)得到一定水平的控制，為將來體內(nèi)人胰島素基因治療糖尿病提供了堅實的理論基礎(chǔ)和實驗