腺病毒介導(dǎo)的PTEN基因治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、9 5 7 3 9 2博士學(xué)位論文( 2 0 0 6 屆)腺病毒介導(dǎo)的P T E N 基因治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究‘E x p e r i m e n t a lS t u d i e so n T h e r a p yf o r L u n g C a r c m o m a b yP T E N G e n e M e 敞e d b y A d e n o v i r u s V e c t o r研究生姓名 徐中華指導(dǎo)教師姓名 錢(qián)海鑫

2、( 教授)專(zhuān)業(yè)名稱(chēng) 外科學(xué)研究方向 肺癌的基因治療論文提交日期 2 0 0 6 年4 月腺病毒介導(dǎo)的P T E N 基因治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究 中文提要結(jié)論：成功構(gòu)建了含P T E N 基因的重組腺病毒載體A d ．P T E N ，酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果相符，T C I D 5 0 法測(cè)定病毒滴度為1 ．0 X 1 0 1 0 p f u ／m l ，為下一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)P T E N對(duì)肺癌的抑制作用研究打下基礎(chǔ)。第二部分：目的：探討A d

3、 - P T E N 對(duì)肺癌細(xì)胞株A 5 4 9 的體外殺傷作用及機(jī)制方法：體外感染A d ．P T E N 于肺腺癌A 5 4 9 細(xì)胞，4 8 h 后應(yīng)用倒置顯微鏡觀察腺病毒A d ．P T E N 感染細(xì)胞后形態(tài)的變化；應(yīng)用R T - P C R 、W e s t e r nb l o t 檢測(cè)A d ．P T E N在A 5 4 9 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)；通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、M T T 實(shí)驗(yàn)，觀察A d ．P T E N 對(duì)A 5 4

4、9細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀( F C M ) 檢測(cè)A d ．P T E N 對(duì)A 5 4 9 細(xì)胞凋亡率的變化；應(yīng)用透射電鏡觀察外源性P T E N 對(duì)A 5 4 9 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果： 經(jīng)A d ．P T E N 感染A 5 4 9 細(xì)胞后4 8 h ，可見(jiàn)部分細(xì)胞由貼壁脫落而呈懸浮生長(zhǎng)，貼壁能力減弱，細(xì)胞形態(tài)變圓，體積縮小，折光性增強(qiáng)，而A d ．L a c Z 組及P B S組細(xì)胞正常生長(zhǎng)；A d - P T

5、E N 轉(zhuǎn)染A 5 4 9 細(xì)胞后應(yīng)用R T - P C R 檢測(cè)到P T E N m R N A 的表達(dá)，A 5 4 9 細(xì)胞經(jīng)A d —P T E N 轉(zhuǎn)染后能夠表達(dá)特異性P T E N 蛋白，大小約5 5 k D a ；經(jīng)A d - P T E N 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于A d - - L a c Z 轉(zhuǎn)染組及P B S 組的細(xì)胞；M T T 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源性P T E N 基因轉(zhuǎn)染顯著抑制了A 5 4 9 細(xì)胞的

6、增殖，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制率增強(qiáng)，而A d - - L a c Z 轉(zhuǎn)染組則無(wú)明顯的抑制作用；轉(zhuǎn)染A d —P T E N 后的A 5 4 9 細(xì)胞經(jīng)F C M 檢測(cè)，細(xì)胞凋亡率明顯升高；透射電鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染P T E N基因組細(xì)胞則呈典型凋亡征象，細(xì)胞膜完整，核染色質(zhì)邊集。結(jié)論：A d ．P T E N 對(duì)肺癌細(xì)胞株A 5 4 9 具有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，能抑制A 5 4 9細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。誘導(dǎo)A 5 4 9 細(xì)胞凋亡，是P T E

7、 N 基因抑制肺癌細(xì)胞增殖的主要作用機(jī)制之一。第三部分：目的：探討A d —P T E N 對(duì)裸鼠肺癌種植瘤體內(nèi)殺傷作用及機(jī)制方法：A 5 4 9 肺腺癌細(xì)胞以2 x 1 0 6 ／1 0 0 p l 皮下接種于B a l b ／C 裸鼠皮下，待成瘤后按腫瘤體積大小相等的原則分為3 組( n - 5 ) ：A d 一”E N 治療組、A d ．L a e Z 對(duì)照組及P B S 空白對(duì)照組，A d ．P T E N 、A d ．L a