腺病毒介導(dǎo)的mCbfa1基因治療骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的以AdEasy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)制備攜帶Cbfa1基因的高滴度腺病毒，感染小鼠成肌細(xì)胞C2C12，利用外源性基因編碼的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)其表達(dá)成骨細(xì)胞表型。再將感染的C2C12與高分子生物材料chronOS支架相復(fù)合，在體外構(gòu)建組織工程化骨，移植修復(fù)小鼠股骨骨缺損，觀察該方法的可行性和有效性，以期找到一種較好的修復(fù)骨缺損的方法。 方法(1)將小鼠Cbfa1基因cDNA克隆到穿梭載體形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Cbfa1，經(jīng)P

2、meI酶切線性化后與骨架質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞AdEasier-1Cells經(jīng)電穿孔法同源重組得到腺病毒質(zhì)粒pAdCbfa1并酶切鑒定，PacI酶切線性化后感染293細(xì)胞包裝后獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdCbfa1。(2)以復(fù)制缺陷重組腺病毒介導(dǎo)小鼠Cbfa1基因感染C2C12后，以MTT法及流式細(xì)胞儀觀察感染對(duì)細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞周期的影響；用RT-PCR法、免疫組化染色以及Westernblot證實(shí)轉(zhuǎn)基因C2C12的Cbfa1蛋白和Ⅰ型膠原的

3、表達(dá)情況；通過改良Gomori鈣鈷法及ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞的ALP活性；通過放免分析試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞的骨鈣素(osteocalcin，OCN)含量。(3)制備孔徑為150～300μm，孔隙率為90％的chronOS與腺病毒感染后的C2C12共培養(yǎng)，電鏡觀察了解細(xì)胞在chronOS上粘附、生長(zhǎng)和合成分泌骨基質(zhì)成分的情況；并在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化骨，通過組織學(xué)觀察了解組織工程化骨形成情況。(4)制備小鼠股骨骨缺損模型，以Cbfa1基

4、因感染的C2C12-chronOS復(fù)合物移植修復(fù)缺損區(qū)，同時(shí)對(duì)側(cè)單純?nèi)斯す莄hronOS修復(fù)組進(jìn)行對(duì)比。術(shù)后分別采用大體觀察、組織學(xué)觀察等方法對(duì)骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行對(duì)比觀察。 結(jié)果(1)酶切鑒定表明Cbfa1基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒且腺病毒重組質(zhì)粒pAdCbfa1構(gòu)建成功；經(jīng)293細(xì)胞包裝3d后可觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)(GFP)，氯化銫梯度離心法最終獲得約3×109efu/L滴度的重組病毒。(2)腺病毒感染后C

5、2C12形態(tài)特征、細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞周期無顯著變化，實(shí)驗(yàn)證實(shí)用Ad-Cbfa1感染的C2C12具有成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)特性。感染后的C2C12的堿性磷酸酶及骨鈣素含量均較未感染組有顯著增高，差異均有顯著性意義(p＜0.05)；Ⅰ型膠原表達(dá)的半定量分析顯示轉(zhuǎn)基因組為1.32±0.16，對(duì)照組為3.65±0.31，差異均有顯著性意義(p＜0.01)。(3)制備得到的chronOS為疏松多孔的網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)，具有一定的韌性和強(qiáng)度。將腺病毒感

6、染的成肌細(xì)胞接種于修剪成一定形狀的chronOS上，經(jīng)電鏡觀察可見細(xì)胞貼附于材料表面和孔隙內(nèi)并增殖。異位成骨實(shí)驗(yàn)證實(shí)該復(fù)合材料可在4至6周時(shí)觀察到有新骨形成。(4)檢測(cè)結(jié)果分析證實(shí)，感染的C2C12修復(fù)骨缺損的成骨速度及成骨量均優(yōu)于單純chronOS組。結(jié)論(1)AdEasy系統(tǒng)是一種方便高效的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，利用其可以使得目的基因得到有效表達(dá)。(2)chronOS是一種良好的骨組織工程的載體材料，有利于種子細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)，并能在體外構(gòu)