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文檔簡介
1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文雙腫瘤靶向基因-病毒治療載體的構(gòu)建及介導(dǎo)抑癌基因HCCS1治療肝癌的實(shí)驗研究姓名:張劍申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師:趙新泰20080401上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文 2Ad-PEG-3p-HCCS1 病毒,通過 PCR 鑒定病毒的正確性。Western blot 檢測PD55-HCCS1 與 5 個對照病毒在正常和惡性肝細(xì)胞中介導(dǎo) E1A 和 HCCS1蛋白表達(dá)的情況。結(jié)晶紫染色觀察各腺病毒的致細(xì)胞病變效
2、應(yīng),MTT 試驗檢測各腺病毒感染后的細(xì)胞存活率。大量擴(kuò)增 PD55-HCCS1,CsCl 梯度離心純化后用空斑形成實(shí)驗測病毒滴度。利用原代培養(yǎng)的 BEL-7404 細(xì)胞成瘤,并通過分組瘤內(nèi)注射 PD55-HCCS1 和 ZD55-HCCS1,比較瘤體的生長曲線和最終的抑瘤率。 免疫組化染色觀察 HCCS1 蛋白在病毒處理瘤體中的表達(dá)情況。 結(jié)果 結(jié)果 重疊延伸 PCR 缺失了 pZD55 載體上 210 bp 的 E1A 啟動子區(qū)域,引
3、入了 Mlu I/Not I/Bcl I 三個酶切位點(diǎn)。PEG-3p 經(jīng) PCR 成功獲得,熒光素酶試驗提示:相對于正常肝細(xì)胞 L-02 而言,其在 BEL-7404、BEL-7405、QGY-7703、HepG2 中的相對活性分別為 3.9、4.7、1.5、2.1 倍。PEG-3p 成功亞克隆入 pMD55 的 E1A 啟動子區(qū)域, 并經(jīng)酶切鑒定, 獲得 pPD55 載體。HCCS1 表達(dá)盒插入該載體中,并成功包裝出雙腫瘤靶向的基因病
4、毒 PD55- HCCS1,純化后經(jīng) PCR 鑒定正確。成功構(gòu)建 pShuttle-PEG-3p-HCCS1,并通過 AdeasyTM 系統(tǒng)得到了非增殖型腺病毒 Ad-PEG-3p-HCCS1,PCR 鑒定正確后,連同 Ad.Null、 ONYX-015、 Ad-CMV-HCCS1、ZD55-HCCS1 共5 個病毒作為 PD55-HCCS1 的對照。Western blot 顯示 PD55-HCCS1 能夠介導(dǎo) E1A 及 HCCS1
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