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1、目的:構(gòu)建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子調(diào)控目的基因MDA-7表達(dá)的復(fù)制缺陷型腺病毒,初探MDA-7蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 方法:通過(guò)基因操作技術(shù)將啟動(dòng)子(hTERTp)+目的基因(MDA-7)插入到腺病毒穿梭載體中,構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同時(shí)構(gòu)建對(duì)照病毒AdTP-EGFP。在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增,氯化銫密度梯度離心純化病毒,TCID50法測(cè)定病毒滴度,應(yīng)用Western blot檢測(cè)經(jīng)腺病毒傳遞的MDA-7在腫瘤
2、細(xì)胞株中表達(dá);通過(guò)結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)差異,拍照。 結(jié)果:成功構(gòu)建攜帶目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pSuTP-mda7,PCR鑒定正確;成功制備腺病毒顆粒AdTP-mda7和Ad-EGFP并測(cè)得AdTP-mda7滴度為2.69×109pfu/ml、AdTP-EGFP滴度為1.8×108pfu/ml。Western blot分析,MDA-7選擇性在多種腫瘤細(xì)胞株中表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,如肺腺癌細(xì)胞株A549
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