血液細(xì)胞靶向性腺病毒載體的構(gòu)建及功能檢測(cè).pdf

1、目前基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法很多，其中包括物理方法、化學(xué)方法、融合法、基因槍等。上述基因轉(zhuǎn)移方法各有優(yōu)點(diǎn)，但共同問題是基因轉(zhuǎn)移效率低，較難獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。腺病毒載體由于具有宿主范圍廣、能制備高滴度病毒、感染效率高、高表達(dá)目的基因、能感染增殖及靜止兩類細(xì)胞、不與宿主細(xì)胞基因組DNA結(jié)合、容許插入大片段外源基因等特點(diǎn)而受到人們的青睞。 多數(shù)用于基因轉(zhuǎn)移的腺病毒載體都來自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2)，但很多血液系統(tǒng)來源的細(xì)胞對(duì)腺病毒感

2、染具有天然的抵抗性，因此限制了該載體在造血研究領(lǐng)域的應(yīng)用。腺病毒纖維蛋白在腺病毒黏附到靶細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵作用，不同腺病毒亞型可能會(huì)具有不同的組織或細(xì)胞趨向性，因?yàn)樗鼈兊睦w維蛋白會(huì)識(shí)別不同的細(xì)胞表面受體。血液細(xì)胞表面具有B組腺病毒Ad11p的高效結(jié)合受體，可以通過對(duì)5型腺病毒載體進(jìn)行纖維改造，使其具有B組腺病毒的趨向性，從而增強(qiáng)對(duì)血液細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移效率。 本研究以AdEasy系統(tǒng)為基礎(chǔ)，先用遞歸PCR的方法人工合成人B組11p型

3、腺病毒的部分纖維(fiber)基因，測(cè)序正確后，經(jīng)過多次的酶切連接操作，將其替換AdEasy骨架質(zhì)粒中的人5型腺病毒的fiber基因，得到新的腺病毒骨架質(zhì)粒命名為AdEasy-1/F11p，應(yīng)用帶有綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)報(bào)告基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP與AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組得到重組腺病毒質(zhì)粒，切取重組腺病毒基因組DNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)