肝癌靶向調(diào)控SEA-CD80基因共表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及抗癌免疫效應(yīng)的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，在腫瘤致死率的病因中占第二位，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命。手術(shù)切除是目前治療肝癌的首選方案，但由于肝癌惡性程度高、發(fā)展迅速、容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，使肝癌總體療效不盡如人意。因此，探索新的肝癌治療方案有著重要的意義。免疫治療通過提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性或效應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)性，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能，以達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的，是繼手術(shù)、放療、化療之后出現(xiàn)的又一腫瘤治療措施，為腫瘤的預(yù)

2、防和治療開辟了新的途徑，近年來發(fā)展十分迅速。 葡萄球菌腸毒素A(SEA)是一種強(qiáng)大的免疫激活劑，它無(wú)需抗原提呈細(xì)胞的加工處理，而是以完整的蛋白形式結(jié)合于MHC-Ⅱ類分子溝槽外側(cè)，激活大量的T細(xì)胞，同時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-2、IFN-γ等，從而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。為了降低SEA在腫瘤治療中對(duì)正常MHC-Ⅱ+細(xì)胞的毒副作用，本室首次構(gòu)建了膜表達(dá)型SEA基因，使SEA表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，目的是使其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)局限在腫

3、瘤局部。SEA誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化需要TCR和CD28介導(dǎo)的活化信號(hào)的共同參與。而CD80是能夠與CD28分子結(jié)合的共刺激分子之一，它與T細(xì)胞表面CD28分子的結(jié)合為T細(xì)胞有效活化提供第二信號(hào)。腫瘤治療的靶向性問題一直為人們所關(guān)注，其中利用腫瘤特異性調(diào)控元件調(diào)控目的基因的表達(dá)是實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療的途徑之一。本研究的目的是利用本室已構(gòu)建的膜表達(dá)型SEA基因，構(gòu)建肝癌特異性AFP基因調(diào)控元件調(diào)控的SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體，通過瘤內(nèi)

4、注射方式感染腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)入SEA和CD80基因，以提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，并提供有效誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的共刺激分子，以誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，對(duì)肝癌進(jìn)行靶向免疫基因治療，觀察其抗癌效應(yīng)并對(duì)其抗癌免疫機(jī)理進(jìn)行初步研究。 1.小鼠甲胎蛋白基因順式調(diào)控元件的選擇性克隆重組及功能研究目的：構(gòu)建并選擇高效的肝癌特異性甲胎蛋白(AFP)基因調(diào)控元件。方法：提取小鼠肝臟DNA，采用PCR方法克隆AFP基因增強(qiáng)子Ⅰ、抑制子和啟動(dòng)子，經(jīng)過不同組合構(gòu)

5、建兩個(gè)真核表達(dá)載體：pEGFP-1-EP(含AFP調(diào)控序列Ⅰ：增強(qiáng)子Ⅰ+啟動(dòng)子)和pEGFP-1-ERP(含AFP調(diào)控序列Ⅱ：增強(qiáng)子Ⅰ+抑制子+啟動(dòng)子)；采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6、黑色素瘤細(xì)胞株B16和成纖維細(xì)胞株NIH3T3，培養(yǎng)48h后，采用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFP在上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況，以判斷AFP調(diào)控序列Ⅰ和Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性及特異性，從中選擇高效的肝癌

6、特異性AFP調(diào)控序列。結(jié)果：所得AFP基因增強(qiáng)子Ⅰ、抑制子和啟動(dòng)子序列與Genebank中公布的相關(guān)序列一致；熒光顯微鏡下：pEGFP-1-EP和pEGFP-1-ERP轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，pEGFP-1(空載體)轉(zhuǎn)染Hepa1-6和三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的B16、NIH3T3細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：pEGFP-1-EP轉(zhuǎn)染Hepa1-6陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度高于pEGFP-1-ERP轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞，兩者

7、陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度均高于pEGFP-1轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞；pEGFP-1轉(zhuǎn)染Hepa1-6和三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16、NIH3T3陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度均較低。結(jié)論：我們所構(gòu)建小鼠AFP基因調(diào)控序列Ⅰ和調(diào)控序列Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性均具有肝癌特異性，且前者高于后者。我們選擇調(diào)控序列Ⅰ作為下一步肝癌特異性基因治療中使用。 2.SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及體外感染肝癌細(xì)胞的研究目的：構(gòu)建肝癌靶向調(diào)控SEA、CD80

8、基因重組腺病毒載體和SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體，了解其感染Hepa1-6細(xì)胞后SEA/CD80的表達(dá)情況及體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖活性。方法：首先利用現(xiàn)有的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-CMV，構(gòu)建新的不帶CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子而帶有polyA加尾信號(hào)穿梭質(zhì)粒，命名為pShuttle2。采用PCR方法從已構(gòu)建載體pLXSN-SEP亞克隆跨膜型SEA(SEAtm)基因，采用RT-PCR方法從小鼠脾臟克隆CD80

9、基因，中間通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internalribosomeentrysite，IRES)序列的連接將SEAtm和CD80克隆至pMD18-T-BIS，將AFP增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、SEA及CD80基因分別從已構(gòu)建的pKS-EP載體和pMD18-T-BIS載體上，分別亞克隆至pShuttle2載體，再與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183。以獲得的重組子轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，分別制備空載體腺病毒Ad-empt

10、y和重組腺病毒Ad-AFP-SEA(SEA)、Ad-AFP-CD80(CD80)、Ad-AFP-BIS(SEA/CD80)，然后分別感染Hepa1-6、NIH3T3和B16細(xì)胞。采用間接免疫熒光法，激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SEA和CD80在細(xì)胞膜表面的表達(dá)情況；對(duì)Hepa1-6細(xì)胞以MOI為100的量感染腺病毒，采用MTT法觀察腺病毒對(duì)Hepa1-6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；采用3H摻入法檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞感染腺病毒后體外誘導(dǎo)淋巴

11、細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果：成功制備了重組腺病毒Ad-AFP-SEA、Ad-AFP-CD80和Ad-AFP-BIS(SEA/CD80)；以制備的重組腺病毒感染Hepa1-6細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示SEA和CD80能夠在Hepa1-6細(xì)胞膜上表達(dá)，而在NIH3T3和B16細(xì)胞中不表達(dá)；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，SEA和CD80能夠在Hepa1-6細(xì)胞膜上共表達(dá)；腺病毒本身對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響；誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：Hepa1-

12、6細(xì)胞感染Ad-AFP-BIS后對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，Hepa1-6細(xì)胞感染Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80后對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)能力高于感染Ad-empty和未感染細(xì)胞。Ad-AFP-SEA和Ad-AFP-CD80感染的Hepa1-6細(xì)胞之間、Ad-empty和未感染的Hepa1-6細(xì)胞之間無(wú)明顯差異。結(jié)論：構(gòu)建了肝癌靶向調(diào)控的SEA、CD80基因重組腺病毒載體和SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒載體；腺病毒能夠

13、介導(dǎo)SEA/CD80在Hepa1-6細(xì)胞膜上的表達(dá)，且體外能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖；對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)直接毒性作用。為進(jìn)一步研究SEA和CD80在肝癌靶向免疫基因治療中的聯(lián)合應(yīng)用及其抗癌免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 3.SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒抗肝癌免疫效應(yīng)的研究目的：檢測(cè)SEA/CD80基因共表達(dá)重組腺病毒的體內(nèi)免疫學(xué)效應(yīng)，及對(duì)肝癌的治療作用。方法：通過瘤體內(nèi)注射重組腺病毒的方式，對(duì)肝癌進(jìn)行免疫基因治療。采用RT-PCR和Wes

14、ternblot方法檢測(cè)注射重組腺病毒后的腫瘤組織和正常肝臟組織表達(dá)SEA和CD80的情況；采用ELISpot方法和LDH釋放實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞中腫瘤特異性IFN-γ分泌細(xì)胞的頻數(shù)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)殺傷活性；觀察重組腺病毒對(duì)腫瘤的治療作用。結(jié)果：注射重組腺病毒后，SEA和CD80能夠有效地在腫瘤組織中表達(dá)，在正常肝臟組織中不表達(dá)；與SEA組、CD80組比較，SEA/CD80組脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量明顯增多

15、(P＜0.01)，CTL對(duì)Hepa1-6細(xì)胞的特異性殺傷作用明顯增強(qiáng)(P＜0.01)；在腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中，SEA/CD80組腫瘤體積明顯小于其它組(P＜0.01)，荷瘤小鼠生存期顯著大于其它組(P＜0.01)。結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的SEA/CD80聯(lián)合免疫基因治療能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性的細(xì)胞免疫，對(duì)肝癌有良好的治療作用。 本研究成功地從小鼠肝臟克隆了AFP增強(qiáng)子Ⅰ、抑制子和啟動(dòng)子，經(jīng)組合后形成兩個(gè)調(diào)控序列：①AFP增強(qiáng)子Ⅰ+啟動(dòng)子

16、(EP)，②AFP增強(qiáng)子Ⅰ+抑制子+啟動(dòng)子(ERP)，并對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩個(gè)調(diào)控序列對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控都具有肝癌特異性，但EP轉(zhuǎn)錄活性高于ERP；成功地從小鼠脾臟克隆了CD80基因，并對(duì)本室首次構(gòu)建的跨膜型SEA(SEAtm)進(jìn)行了亞克隆，利用現(xiàn)有的穿梭質(zhì)粒pShuttle和pShuttle-CMV構(gòu)建了新的多克隆位點(diǎn)上游不帶啟動(dòng)子，下游帶有SV40polyA加尾信號(hào)的穿梭質(zhì)粒，采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)，

17、通過SEA和CD80基因中間插入IRES元件首次構(gòu)建了肝癌靶向性SEA/CD80共表達(dá)重組腺病毒載體Ad-AFP-BIS；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ad-AFP-BIS感染腫瘤細(xì)胞后，能夠使腫瘤細(xì)胞有效地共表達(dá)CD80和跨膜型SEA，且體外能夠誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞的增殖，體內(nèi)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生肝癌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)；荷瘤小鼠經(jīng)瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-AFP-BIS治療后，能抑制Hepa1-6肝癌的生長(zhǎng)，提高荷瘤小鼠的生存率，延長(zhǎng)生存期。本研究為肝癌的靶向免