以GFP為報(bào)告基因的多基因共表達(dá)慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是不僅是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子病理機(jī)制的重要手段,而且為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療帶來(lái)了新的希望。其關(guān)鍵之一就是選擇良好的轉(zhuǎn)基因載體。近年來(lái)慢病毒載體以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而越來(lái)越被人們所關(guān)注。慢病毒載體(LV,lentiviral vector)來(lái)源于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1),其致病基因已經(jīng)被剔除,它能感染包括神經(jīng)元在內(nèi)的非分裂細(xì)胞、感染效率高、免疫原性低,可攜帶轉(zhuǎn)基因整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)而長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)所攜帶目的

2、基因。因大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由多個(gè)基因共同作用所致,故進(jìn)行基因治療時(shí)需要選擇能夠同時(shí)上調(diào)(強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))目的基因或下調(diào)(siRNA基因沉默)多個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)基因載體。因此當(dāng)前慢病毒載體研究的一個(gè)方向即是構(gòu)建多基因共表達(dá)載體。此外,因?yàn)槁《靖腥舅拗骷?xì)胞時(shí)無(wú)明顯的感染標(biāo)記,故進(jìn)行滴度測(cè)定時(shí)極為不便,目前尚缺快速穩(wěn)定的滴度測(cè)定方法。
　　針對(duì)上述問(wèn)題,本研究利用分子克隆方法構(gòu)建了一套多基因共表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng),此系統(tǒng)可用以構(gòu)建多si

3、RNA、報(bào)告基因GFP和目的基因共表達(dá)的慢病毒載體?？蓪FP作為感染標(biāo)記,采用標(biāo)準(zhǔn)的TCID50法計(jì)算病毒滴度,建立了一種方便快捷的慢病毒滴度測(cè)定方法,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療建立了一個(gè)實(shí)用工具。
　　目的:
　　1.構(gòu)建多個(gè)siRNA表達(dá)盒,GFP及目的基因共表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)pLKO-M和pSi-shutle。
　　2.和慢病毒包膜質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)GFP的慢病毒顆粒并建立慢病毒滴度

4、的TCID50快速測(cè)定方法。
　　方法:
　　1.現(xiàn)有慢病毒載體pLKO-1-puro的多克隆位點(diǎn)的改建:設(shè)計(jì)并合成新的多克隆位點(diǎn)(AgeI、EcoRI、XbaI、SalI和MluI)序列,退火后連接到經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切的pLKO-1-puro載體質(zhì)粒上,形成重組質(zhì)粒pLKO-1-puro-MCS;轉(zhuǎn)化大腸桿菌(escherichia coli,E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性菌落、擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,Mlu

5、I和BamHI雙酶切鑒定。
　　2.CMV啟動(dòng)子-GFP-IRES-MCS元件克隆至pLKO-1-puro-MCS:以pGFP-IRES為模板設(shè)計(jì)引物,用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增出約2.4kb片段,XbaI和SalI酶切后克隆至pLKO-1-puro-MCS的XbaI和SalI位點(diǎn)處,XbaI和lSalI酶切鑒定。
　　3.配套質(zhì)粒pSi-shutle的構(gòu)建:設(shè)計(jì)INPTEN1和INPTEN2引物,PCR擴(kuò)增pSilencer

6、2.0,得到421bp片段,將其克隆至pENTR-U6-con,得pSi-shutle,SalI和XbaI酶切鑒定陽(yáng)性菌落。
　　4.用脂質(zhì)體2000將重組載體質(zhì)粒PLKO-M、輔助質(zhì)粒pCMV-dR8.2 dvpr和包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒,在25000rpm、4℃條件下離心90min濃縮病毒顆粒。
　　5.TCID50法測(cè)定慢病毒滴度:將病毒顆粒進(jìn)行系列稀釋后感染2個(gè)

7、96孔板內(nèi)Vero細(xì)胞,48小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)產(chǎn)生綠色熒光的孔數(shù)并計(jì)算滴度。
　　結(jié)果:
　　1.含新的多克隆位點(diǎn)(MCS)的寡核苷酸鏈被成功克隆到慢病毒載體質(zhì)粒pLKO-1-puro中,得pLKO-1-puro-MCS,經(jīng)過(guò)酶切鑒定證明構(gòu)建成功。
　　2.CMV啟動(dòng)子-GFP-IRES-MCS元件被成功克隆至pLKO-1-puro-MCS,酶切鑒定正確。
　　3.pSilencer2.0質(zhì)粒上的siR

8、NA表達(dá)盒被成功克隆至pENTR-u6-con,酶切和測(cè)序鑒定正確。
　　4.三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T48小時(shí)后可見(jiàn)GFP表達(dá),72小時(shí)后收獲慢病毒顆粒并進(jìn)行了濃縮。
　　5.將濃縮后的病毒系列稀釋后感染2個(gè)96孔板內(nèi)Vero細(xì)胞,48小時(shí)后出現(xiàn)綠色熒光,用TCID50法計(jì)算得出濃縮后的病毒感染單位(IU)均值為6.47X106TU/ml。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了siRNA表達(dá)盒和GFP-目的基因共表達(dá)的慢病